本文選題：食源性肽　切入點(diǎn)：WY　出處：《南昌大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：食源性肽WY、WJ是以食物來(lái)源的蛋白質(zhì)(魚類蛋白和禽類蛋白)為反應(yīng)底物經(jīng)蛋白酶酶解制得肽產(chǎn)物。5-氟尿嘧啶為臨床常用的抗代謝類腫瘤治療藥物,因其代謝轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核甘酸,抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制合成,造成DNA損傷,從而發(fā)揮抗腫瘤作用,該過(guò)程同樣會(huì)作用于正常細(xì)胞,如抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成,延遲傷口愈合。H2O2是一種重要的活性氧,極易透過(guò)細(xì)胞膜,與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過(guò)Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基,作用于生物大分子,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致諸如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、癌癥等的發(fā)生。本文采用MTT法、單細(xì)胞凝膠電泳及流式細(xì)胞儀等技術(shù)手段,研究食源性肽WY、WJ對(duì)抗5-氟尿嘧啶的細(xì)胞毒作用及其抗H202誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用,主要研究結(jié)論歸納如下： 1、利用70%乙醇將食源性肽WY分離為醇溶部分WY-1,沉淀部分WY-2；將食源性肽WJ分為醇溶部分WJ-1,沉淀部分WJ-2。采用葡聚糖凝膠色譜法分別測(cè)定WY, WY-1, WY-2, WJ, WJ-1, WJ-2的分子量分布。結(jié)果表明,WY和WY-2主要是分子量大于2000Da的活性肽,WY-1主要是分子量小于2000Da的成分,且分子量小于245.611Da的成分占54.4%。WJ和WJ-1均是分子量為240Da左右的小肽,WJ-2其主要組成部分為分子量是400Da的組分,含量約占70%。 2、采用氨基酸分析儀測(cè)定WY, WY-1, WY-2, WJ, WJ-1, WJ-2的氨基酸組成,氨基酸測(cè)定結(jié)果表明WY, WY-1, WY-2均含有豐富的谷氨酸和甘氨酸。氨基酸測(cè)定結(jié)果表明,WJ主要含有谷氨酸、甘氨酸；WJ-1主要含有天門冬氨酸、甘氨酸；WJ-2主要含有亮氨酸、甘氨酸。 3、采用MTT法研究以上各組分對(duì)HSF細(xì)胞增殖作用,通過(guò)比較WY、 WY-1和WY-2對(duì)HSF細(xì)胞72h增殖作用影響,發(fā)現(xiàn)WY-2的促增殖作用明顯高于WY、WY-1和肌肽,而WY和WY-2的效果和肌肽沒(méi)有明顯差別。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究WY-2對(duì)HSF細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響,結(jié)果表明WY-2可促進(jìn)HSF細(xì)胞的增殖作用,且在對(duì)數(shù)期對(duì)其增值作用最為明顯,平穩(wěn)期增殖作用逐漸減弱,并沒(méi)有改變HSF細(xì)胞自然的生長(zhǎng)規(guī)律。 4、通過(guò)比較不同濃度的WJ、WJ-1和WJ-2對(duì)HSF細(xì)胞72h增殖作用影響,發(fā)現(xiàn)WJ-1的促增殖作用明顯高于WJ-2和肌肽,而WJ-2的效果和肌肽沒(méi)有明顯差別,說(shuō)明食源性肽WJ的活性成分是分子量大約為230Da作用的小肽。根據(jù)篩選出來(lái)的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究WJ-1對(duì)HSF細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響,結(jié)果表明WJ-1促進(jìn)HSF細(xì)胞的增殖作用,且在對(duì)數(shù)期對(duì)其增值作用最為明顯,平穩(wěn)期增殖作用逐漸減弱,并沒(méi)有改變HSF細(xì)胞自然的生長(zhǎng)規(guī)律。 5、采用MTT法研究食源性肽WY、WY-1、WY-2、WJ、WJ-1、WJ-2對(duì)5-FU誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞增殖抑制的影響。結(jié)果表明以上樣品作用濃度范圍內(nèi)對(duì)HSF細(xì)胞均無(wú)毒害作用,均能抵抗5-FU誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞增殖抑制,但在不同劑量5-FU、不同孵育時(shí)間、不同樣品濃度時(shí),不同樣品表現(xiàn)出的保護(hù)作用不同,保護(hù)程度也有差異。其中,WY-2和WJ-1受這些因素影響較小,有較強(qiáng)較廣泛的保護(hù)作用,但具體的保護(hù)機(jī)制及作用規(guī)律有待于進(jìn)一步探討。 6、利用MTT法和單細(xì)胞凝膠電泳法研究不同濃度的5-FU對(duì)HSF細(xì)胞增殖作用和DNA損傷的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)100μg/mL的5-FU作用HSF細(xì)胞24h,細(xì)胞存活率在80%以上,而細(xì)胞DNA損傷率已達(dá)98.09%,從而建立了體外5-FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞DNA損傷的模型平臺(tái)。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明,食源性肽WY和WJ組細(xì)胞彗星尾長(zhǎng),尾矩,Olive尾距和尾部DNA百分含量與5-FU組比較明顯減少,WY, WJ均可有效地減少5-FU引起的HSF細(xì)胞DNA的斷裂損傷。體外實(shí)驗(yàn)表明食源性肽WY和WJ可以有效對(duì)抗細(xì)胞DNA損傷,其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。 7、對(duì)HSF細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,確定了HSF細(xì)胞達(dá)半數(shù)致死率時(shí)的H2O2濃度(500μmol/L),從而建立了體外過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HSF細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究食源性肽WY和WJ對(duì)高劑量短時(shí)間H202作用誘導(dǎo)HSF細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,WY-2的對(duì)HSF細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于WY和WY-1, WJ-1對(duì)HSF細(xì)胞的保護(hù)作用要強(qiáng)于WJ和WJ-1。 8、采用MTT法研究WY-2, WJ-1,及其配伍作用對(duì)低劑量長(zhǎng)時(shí)間H2O2(10μmol/L)作用誘導(dǎo)HSF細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,WY-2, WJ-1分別對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)HSF細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷均有保護(hù)作用,且呈劑量依賴性。WY-2和WJ-1配伍后,可能是其成分相互影響的原因,保護(hù)作用要強(qiáng)于它們單獨(dú)作用,說(shuō)明WY-2和WJ-1具有協(xié)同作用。 9、采用MTT法研究WY、WY-1、WY-2、WJ、WJ-1、WJ-2對(duì)H22細(xì)胞的抑制作用的影響。結(jié)果表明,不同濃度食源性肽作用H2248h均能顯著性的抑制H22的生長(zhǎng)。250μg/mL的WY, WY-1和WY-2對(duì)H22的抑制率分別為21.6%,27.9%和34.2%。在50μg/mL的作用濃度下WJ, WJ-2和肌肽對(duì)H22的抑制作用最強(qiáng),抑制率分別為24.6%,23%和13.1%,WJ-1在250μg/mL作用濃度下對(duì)H22的抑制率達(dá)到29.4%。WY-2與5-FU, WJ-1與5-FU也具有協(xié)同作用,但是協(xié)同作用并不明顯,WY-2與WJ-1配伍后雖沒(méi)有協(xié)同5-FU抗癌作用,但不影響其抗腫瘤作用。 10、采用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究食源性肽WY-2、WJ-1及其配伍對(duì)H22細(xì)胞周期的影響。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明,不同濃度的WY-2可誘導(dǎo)H22細(xì)胞在G0/G1期積蓄,但不能促進(jìn)其S期的積蓄；250μg/mL的WJ-1、50-250μg/mL范圍內(nèi)的WY-2+WJ-1和10-250μg/mL范圍內(nèi)的肌肽均能使S期的H22細(xì)胞數(shù)均明顯升高,G0/G1期細(xì)胞減少；說(shuō)明它們均可誘導(dǎo)H22細(xì)胞S期的積蓄,有助于提高S期時(shí)特異性化療藥物的敏感性。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R151.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1666528