本文選題：克羅諾桿菌　切入點：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景和目的 克羅諾桿菌(Cronobacter spp.)是一種重要的新型食源性致病菌,是囊括了原來所有阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的新屬,該屬的細(xì)菌是人和動物腸道內(nèi)寄生的一種有周生鞭毛,能運(yùn)動,兼性厭氧的革蘭陰性無芽孢桿菌。該菌呈世界性分布,主要通過嬰幼兒配方奶粉經(jīng)消化道感染兒童,引起新生兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎,甚或遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或?qū)е滤劳觥?自1961年首次報道由克羅諾桿菌引起的兩例腦膜炎病例,隨后在全球范圍內(nèi)相繼出現(xiàn)了由該菌引起的疾病報道。2001年4月,在美國某醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室一早產(chǎn)兒發(fā)燒、心動過速,腦脊液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌,診斷為腦膜炎,用抗生素治療無效,9d后死亡。擴(kuò)大檢查該院49名嬰兒的糞便和尿液,發(fā)現(xiàn)10人為阪崎腸桿菌陽性,其原因是使用了某批Portagen的嬰兒配方奶粉。而且在該批奶粉中也檢查出了克羅諾桿菌,結(jié)果導(dǎo)致Portagen嬰兒配方奶粉于2002年4月被召回。1998年,在比利時有12名嬰兒因哺喂同一牌號的嬰兒配方奶粉而發(fā)生小腸結(jié)腸炎壞死。在這些嬰兒的糞便和該批奶粉中同時分離出克羅諾桿菌,當(dāng)該批奶粉停用后,未有新的病例發(fā)生。2004年安徽阜陽劣質(zhì)嬰兒配方奶粉事件引起我國政府的高度重視,并且首次從87份嬰兒配方奶粉中分離到11株該菌,檢出率達(dá)12.16%。盡管專家目前認(rèn)為是由于奶粉的營養(yǎng)比例問題導(dǎo)致小孩畸形和死亡,但是從生病小孩的臨床癥狀看,小孩頭部腫大和反應(yīng)遲鈍與克羅諾桿菌感染的癥狀相似,可能該菌在致病中起到重要作用。近期研究表明,克羅諾桿菌是一種廣泛存在的微生物,不僅能夠存在于污染的食品和食品工廠當(dāng)中,而且在幾乎所有的環(huán)境中均能夠分離得到。到目前為止已從奶酪、豬肉、蔬菜、谷類、草藥、香辛料,和經(jīng)過UHT滅菌的牛奶等食品中分離出克羅諾桿菌。克羅諾桿菌致死率為10～80%,但是作為一種條件性致病菌,對新生兒具有更為嚴(yán)重的危害性,其嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生安全和人類健康。 目前,針對克羅諾桿菌的檢測方法主要有FDA推薦的分離培養(yǎng)、生化及血清學(xué)鑒定、免疫學(xué)方法和PCR。傳統(tǒng)的檢測和定量方法主要是采用選擇性培養(yǎng)基,通過增菌和選擇培養(yǎng)來實現(xiàn),但其中主要存在三大問題,一是通常情況下,致病菌在食品檢測樣品中的量很少,在樣品處理和檢測中容易出現(xiàn)人為的差錯；二是非常繁瑣和耗時,檢測速度慢,通常需要6d以上；三是許多致病菌在常規(guī)檢測中屬難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物,靈敏度較低；免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度均較低；PCR法敏感、準(zhǔn)確、快速,可替代傳統(tǒng)檢測方法,但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程,以及對檢測人員較高的技術(shù)要求,而使其難以在基層單位推廣和普及。因此,建立一種特異富集、快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法,對克羅諾桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查和防治工作十分重要。 1、樣品富集技術(shù)——免疫磁珠分離法(immunomagnetic separation,IMS) 生物樣品往往是復(fù)雜的混合物,除少數(shù)特殊樣品外,不能直接用于檢測,因此需要進(jìn)行樣品前處理這一重要步驟。傳統(tǒng)的樣品處理方法是從樣品中分離目的微生物,通常使用選擇性培養(yǎng)基來獲得單個純化的目的微生物。如果對于受到損傷的和熱應(yīng)激微生物還需經(jīng)過增菌培養(yǎng),增菌過程應(yīng)包括前增菌、選擇性增菌和后增菌,因此從樣品中檢測病原微生物需很長的時間,而實際檢測時間主要是等待增菌的時間,這樣就遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)快速檢測的需要。由于免疫磁珠分離法能特異性吸附目的細(xì)菌,受到了不少學(xué)者的關(guān)注。 免疫磁珠是由直徑3-5微米,有一定磁性,且分散度良好的微珠經(jīng)不同單克隆抗體包被而成的顆粒,而免疫磁珠分離方法是于70年代中期發(fā)展起來的一項免疫學(xué)技術(shù),其分離原理是通過磁珠表面包被的細(xì)胞特異性抗體與細(xì)胞表面標(biāo)記分子間特異結(jié)合,使抗原陽性細(xì)胞與抗原陰性細(xì)胞相分離,具備了固相化試劑特有的優(yōu)點以及免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性,被廣泛應(yīng)用于多種血液細(xì)胞的分離,蛋白質(zhì)的純化,以及對食品、水、生物樣品、環(huán)境等標(biāo)本中病原微生物的分離和檢測工作中,顯示出良好的開發(fā)應(yīng)用前景。 IMS用于微生物檢測領(lǐng)域的原理是：用特異性抗體包被在磁珠表面來捕獲檢樣(或增菌液)中的目標(biāo)微生物,然后在磁場的作用下被吸附沉淀,使菌株與影響和干擾檢測靈敏度的檢樣殘渣和其他雜菌分離開,起到濃縮作用,從而提高檢測的靈敏度和檢出率。IMS方法操作簡便,只需在檢測樣品或者增菌液中加入免疫磁珠,室溫振蕩混勻一定的時間后,在磁場作用下反復(fù)用緩沖液洗滌即可,捕獲目標(biāo)菌的免疫磁珠不用與目標(biāo)菌分離,直接進(jìn)行后續(xù)實驗。具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡單,不需要昂貴的儀器設(shè)備；不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能等優(yōu)點,從而在微生物檢測方面具有很大的優(yōu)勢。 2、快速檢測技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)是日本學(xué)者Notomi等建立的一種新的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù),其原理是,針對靶基因的6或8個區(qū)域設(shè)計4或6種特異性引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(約65℃)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP能夠高效、快速、靈敏、特異地擴(kuò)增靶DNA,操作簡便,成本低,適于大規(guī)模樣品的檢測和基層單位推廣應(yīng)用,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、病原微生物檢測以及動物胚胎的性別鑒定等。 因此,本實驗將結(jié)合上述兩種技術(shù),采用免疫磁珠分離富集樣品中克羅諾桿菌,建立其快速的LAMP檢測技術(shù)。首先建立克羅諾桿菌免疫磁珠特異性捕獲技術(shù),并進(jìn)行磁珠模擬研究。然后針對克羅諾桿菌的特異性外膜蛋白OmpA基因,設(shè)計內(nèi)外引物,運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測被富集的克羅諾桿菌,建立用于克羅諾桿菌快速靈敏的IMS-LAMP檢測方法。并利用已經(jīng)建立的免疫磁珠分離乳制品中克羅諾桿菌的方法,對人工污染克羅諾桿菌的乳制品進(jìn)行LAMP檢測,同時采集209份市售配方奶粉進(jìn)行檢測,結(jié)果與傳統(tǒng)國標(biāo)法進(jìn)行比較。 二、研究方法 1、建立克羅諾桿菌免疫磁珠特異性捕獲技術(shù),并進(jìn)行磁珠模擬研究。制備克羅諾桿菌(ATCC29544、ATCC51329、奶粉分離株)、非目標(biāo)菌(大腸桿菌、副溶血性弧菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等)的菌懸液,利用克羅諾桿菌特異性免疫磁珠進(jìn)行捕獲,接種平板后進(jìn)行菌落計數(shù),并計算免疫磁珠的特異性吸附效率。同時設(shè)計干擾試驗,在含有104cfu/ml的大腸桿菌菌懸液中,加入不同濃度的目標(biāo)菌,用磁珠進(jìn)行捕獲,評估免疫磁珠的特異性富集效率。在經(jīng)3h和6h預(yù)增菌的含有已知量目標(biāo)菌的奶粉模擬標(biāo)本及未增菌的糞便模擬標(biāo)本中,分別加入磁珠進(jìn)行捕獲,評估基于免疫磁珠捕獲法的克羅諾桿菌檢測流程的可行性。 2、根據(jù)克羅諾桿菌外膜蛋白o(hù)mpA基因序列(Accession number:DQ000206)的保守區(qū),設(shè)計出特異的LAMP引物,對各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,建立25μL的LAMP反應(yīng)體系。 3、以20株實驗菌株基因組DNA為模板,建立LAMP與PCR法檢測方法,并對比兩者的特異性；將過夜培養(yǎng)的克羅諾桿菌ATCC29544標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行稀釋,分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增,比較兩者的靈敏度。 4、模擬樣品的檢測：購買奶粉樣品(克羅諾桿菌陰性)3份,分別用ATCC29544進(jìn)行接種,隨后做LAMP和PCR檢測,并與國標(biāo)法進(jìn)行比較。 5、收集國產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉209份,通過免疫磁珠富集,IMS-LAMP技術(shù)檢測,并與國標(biāo)法進(jìn)行比較。 三、結(jié)果 1、菌落計數(shù)表明,制備的克羅諾桿菌免疫磁珠對克羅諾桿菌ATCC29544、 ATCC51329和實驗室分離株的捕獲效率均超過30%,對6種非目標(biāo)菌的非特異性吸附效率3%。干擾試驗結(jié)果顯示,與常規(guī)直接平板接種法相比,免疫磁珠捕獲法的敏感性提高了約100倍；奶粉和糞便模擬試驗的結(jié)果顯示,免疫磁珠捕獲法的最低檢測限分別可達(dá)101cfu/25g和101cfu/mL,并提高了標(biāo)本中目標(biāo)菌的檢出率。 2、成功建立優(yōu)化的克羅諾桿菌LAMP反應(yīng)體系,具體為(25μL):6mmol/L MgCl2,0.6mmol/L dNTPs,0.8mol/L甜菜堿,1.6μmo/L內(nèi)引物,0.4μmo/L外引物,1μL的Bst DNA聚合酶(8U),10×Thermopol buffer以及2μL模板；最佳反應(yīng)條件：58℃,反應(yīng)60min。經(jīng)過免疫磁珠富集后,LAMP法檢出克羅諾桿菌ATCC29544的特異性較PCR法高,LAMP的檢測限為101cfu/ml。 3、對于模擬樣品,LAMP和PCR與國標(biāo)檢測結(jié)果一致,均可檢出3份模擬克羅諾桿菌陽性樣品。 4、對209份實際嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行檢測,其中IMS-LAMP檢測為16份陽性,國標(biāo)法檢測15份陽性,無統(tǒng)計學(xué)差異,因此其檢測結(jié)果一致、可信,但大大縮短了檢測時間。 四、結(jié)論 本研究建立克羅諾桿菌免疫磁珠特異性捕獲技術(shù),同時以克羅諾桿菌的外膜蛋白OmpA基因序列作為靶序列,設(shè)計一套LAMP引物進(jìn)行擴(kuò)增,并對各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,保證了方法的可靠性和特異性。對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌以及金黃色葡萄球菌等非克羅諾桿菌共10株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,均未出現(xiàn)陽性結(jié)果,特異性強(qiáng)。對細(xì)菌培養(yǎng)物檢測限為101cfu/mL,在檢測靈敏度上具有更大的優(yōu)勢。建立的IMS-LAMP法能直接對奶粉等食品中的克羅諾桿菌進(jìn)行檢測,與傳統(tǒng)國標(biāo)檢測方法相比,大大縮短了檢測時間,節(jié)省了人力、物力。而且IMS-LAMP方法操作簡單,反應(yīng)快速,在恒溫條件下進(jìn)行,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物2-3h完成,奶粉樣品26h完成(國標(biāo)法需要6d),耗時短；同時,使用恒溫水浴裝置即可完成反應(yīng),不需要使用昂貴、精密的儀器設(shè)備,實現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物檢測一步完成,操作簡便,檢測成本低。 綜上所述,本研究建立的克羅諾桿菌IMS-LAMP檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、成本低等特點,為克羅諾桿菌的檢測提供了新的發(fā)展方向,有望成為簡易的常規(guī)檢測手段,尤其適用于基層檢驗檢疫機(jī)構(gòu),對于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全和推動食品國際貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李啟明;馬學(xué)軍;高寒春;周蕊;匡治州;侯云德;;逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因檢測中的應(yīng)用[J];病毒學(xué)報;2008年03期

2 劉光明,蘇文金,蔡慧農(nóng),謝明星,劉棠,彭小莉;空腸彎曲菌的磁捕獲_-熒光PCR檢測方法的建立[J];生物工程學(xué)報;2005年02期

3 吳陽升,羅淑萍;一種新的高效快速核酸恒溫擴(kuò)增方法——LAMP法[J];生物技術(shù);2004年04期

4 張凡非,杉山寬治,西尾智裕,鄉(xiāng)田淑明,秋山真人;利用免疫磁珠法分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌的研究[J];中國衛(wèi)生監(jiān)督雜志;2004年01期

5 葉應(yīng)旺;吳清平;郭偉鵬;張菊梅;董曉暉;;種特異性PCR快速檢測奶粉中阪崎腸桿菌研究[J];微生物學(xué)通報;2007年06期

6 肖斌,朱永紅,鄒全明;簡便敏感的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增基因診斷新技術(shù)[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2005年07期

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本文編號：1650508