本文選題：血紅素　切入點：HCP1　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：血紅素是原卟啉與二價鐵的絡(luò)合物，在生物體中廣泛存在，其重要的生理功能已經(jīng)被人們廣為熟知：是機體鐵的最大來源；是組成血紅蛋白、肌紅蛋白的原料，對紅細胞的成熟和分化至關(guān)重要，是線粒體功能維持不可或缺的物質(zhì)等等。正常情況下血液中游離血紅素水平并不高，大部分是以蛋白結(jié)合的形式存在。但在某些特殊的生理或病理條件下，比如出血、紅細胞破裂或細胞損傷等，則會釋放大量的血紅素，造成局部血紅素過高。而過多的游離血紅素將產(chǎn)生大量的自由基，造成脂質(zhì)過氧化，一旦進入細胞，對細胞產(chǎn)生嚴重的毒性作用。為了有效維持穩(wěn)定的血紅素水平，機體細胞通過感受細胞內(nèi)微小血紅素池的變化，控制血紅素的合成、分解和轉(zhuǎn)運等途徑。 近年來，隨著血紅素轉(zhuǎn)運體的逐步發(fā)現(xiàn)，血紅素在機體的轉(zhuǎn)運越來越受到人們的關(guān)注。2005年Shayeghi等首次證實了十二指腸上皮細胞血紅素轉(zhuǎn)運蛋白（HCP1）具有直接攝取血紅素并將其轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)的功能，進入細胞的血紅素在加氧酶的作用下分解，其中的鐵進入細胞內(nèi)的鐵池被重新利用，血紅素轉(zhuǎn)運蛋白的發(fā)現(xiàn)明確了由膳食中血紅素鐵到機體可利用鐵的過程。 隨后的研究，人們也開始關(guān)注HCP1在小腸細胞以外細胞的表達及血紅素攝取。研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜色素上皮細胞同樣表達HCP1，依賴HCP1攝取的血紅素參與色素合成，對維持上述細胞功能穩(wěn)定意義重大。此外，大量的研究表明，腦鐵代謝紊亂與眾多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在培養(yǎng)的大鼠原代星形膠質(zhì)細胞，血紅素同樣能夠通過HCP1進入細胞，在短時間內(nèi)即可看到細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的鐵顆粒聚集。研究還指出，在出血性腦卒中情況下，紅細胞破壞釋放大量血紅素，此時細胞通過HCP1途徑快速攝取血紅素將會加劇該病的惡化，并增加死亡率�？梢�，HCP1的重要功能不僅僅是小腸細胞的血紅素轉(zhuǎn)運體，介導(dǎo)腸道膳食血紅素鐵的吸收；同時也對機體其它細胞乃至組織器官功能穩(wěn)定的維持具有積極的作用。 肝臟，作為鐵代謝和鐵儲存最重要的器官，血紅素在肝臟的合成、分解和轉(zhuǎn)運研究歷來受到人們的重視。然而，血紅素在肝臟的轉(zhuǎn)運以及肝細胞攝取血紅素的具體途徑和調(diào)控機制卻一直未有明確闡明。早期的研究提出，血紅素具有親脂特性，可通過擴散作用跨過細胞膜進入肝細胞；也有研究指出，血紅素是與血液結(jié)合素形成復(fù)合物，通過細胞膜內(nèi)陷吞噬作用進入肝細胞；但近年來的研究大多認為肝細胞對血紅素的攝取是一個依賴能量的過程，并且是需要轉(zhuǎn)運體協(xié)助，受特定機制調(diào)控的途徑。因此，血紅素轉(zhuǎn)運蛋白（HCP1）的途徑可能是最支持上述觀點的。對HCP1的表達研究已經(jīng)證實，HCP1在肝臟以及肝癌細胞上均有明顯表達。但是肝細胞是否同樣能夠通過HCP1攝取血紅素，以及其攝取血紅素的影響因素和調(diào)控機制卻并不清楚。 本課題擬通過細胞實驗，用含血紅素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞，通過原子吸收法、普魯士藍染色法、以及將肝細胞HCP1基因進行特異性干擾和過表達等方法，觀察肝細胞HCP1血紅素的攝取功能，明確肝細胞是否可以通過HCP1攝取血紅素；并通過細胞實驗和動物實驗探討肝細胞HCP1血紅素攝取的影響因素以及HCP1表達變化的可能分子機制。 研究目的 通過觀察肝細胞對血紅素的攝取變化，明確肝細胞是否可以通過HCP1攝取血紅素，并探討肝細胞HCP1攝取血紅素的影響因素以及HCP1表達變化的可能分子機制。研究結(jié)果將有助于進一步認識肝臟鐵的吸收機制，豐富肝鐵代謝理論知識；同時也為鐵缺乏、鐵負荷等鐵代謝異�；颊叩念A(yù)防和治療提供新的思路和潛在治療靶點。 研究方法 一、肝細胞HCP1攝取血紅素功能的觀察 1．肝細胞HCP1表達量測定和細胞株選擇PCR檢測人肝細胞（HL7702, L02細胞）和肝癌細胞（HepG2細胞）的表達量，產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳鑒定。 2．含血紅素培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞，檢測細胞活性和細胞內(nèi)鐵含量 不同濃度不同時間血紅素培養(yǎng)肝細胞，采用CCK8試劑盒檢測血紅素對肝細胞活性的影響；用原子吸收法測量細胞內(nèi)的鐵含量；用普魯士藍染色法檢測細胞內(nèi)鐵顆粒的聚集狀況， 3.干擾肝細胞HCP1基因表達，檢測細胞對血紅素的攝取變化 設(shè)計并合成HCP1干擾RNA（HCP1siRNA）,轉(zhuǎn)染L02細胞，采用實時熒光定量PCR法檢測干擾效果；成功干擾后再加血紅素培養(yǎng)細胞（同2培養(yǎng)），原子吸收法測定肝細胞內(nèi)鐵含量。 4.過表達肝細胞HCP1基因，檢測細胞對血紅素的攝取變化 設(shè)計并構(gòu)建HCP1過表達質(zhì)粒（pHCP1），轉(zhuǎn)染人肝細胞L02細胞，Real Time PCR法檢測過表達效果；肝細胞HCP1成功過表達后再加血紅素培養(yǎng)（同2），原子吸收法測定細胞內(nèi)鐵含量。 5.肝細胞用含鋅卟啉的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細胞內(nèi)熒光變化 用鋅卟啉（血紅素類似物，激發(fā)后發(fā)紅色熒光）培養(yǎng)肝細胞，熒光顯微鏡下觀察肝細胞HCP1是否能攝取鋅卟啉。 肝細胞HCP1基因干擾和過表達后，再加鋅卟啉培養(yǎng)，觀察此時細胞內(nèi)的熒光變化。 二、肝細胞HCP1血紅素攝取的影響因素探討 1.鐵含量對肝細胞和肝臟HCP1表達的影響 由于多數(shù)的鐵代謝相關(guān)蛋白表達都受到細胞內(nèi)鐵含量的調(diào)控，所以首先檢測了鐵含量對肝細胞HCP1的表達是否有影響。通過檢測不同鐵含量培養(yǎng)的肝細胞以及不同鐵負荷下的小鼠肝臟HCP1表達情況，推測肝細胞內(nèi)鐵儲存狀態(tài)對HCP1血紅素攝取的影響。 （1）高鐵和缺鐵環(huán)境培養(yǎng)對肝細胞HCP1表達的影響 細胞分組如下處理，缺鐵組（加去鐵胺DFO培養(yǎng)），高鐵組（加離子鐵、血紅素鐵培養(yǎng)），對照組（L02細胞正常培養(yǎng)）。實時熒光定量PCR和western blot法檢測細胞內(nèi)鐵含量對HCP1mRNA和蛋白表達水平的影響。 （2）不同鐵營養(yǎng)狀況小鼠肝臟HCP1的表達 建立不同鐵營養(yǎng)狀況的小鼠模型，缺鐵組（喂飼缺鐵飼料），高鐵組（喂飼缺鐵飼料+注射右旋糖酐鐵總量12mg），對照組（喂飼缺鐵飼料+注射右旋糖酐鐵總量1.2mg），造模2周。2周后處死小鼠，眼球取血，生化儀器檢測血清鐵代謝相關(guān)參數(shù)變化；取肝臟，原子吸收法檢測肝臟鐵含量，實時熒光定量PCR和western blot法檢測不同鐵營養(yǎng)狀況小鼠肝臟HCP1表達變化。 2.糖皮質(zhì)激素對肝細胞HCP1表達和血紅素攝取的影響 課題組前期通過基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激中皮質(zhì)酮明顯升高的大鼠，其肝臟HCP1表達亦升高，而已有的文獻也表明糖皮質(zhì)激素可以誘導(dǎo)巨噬細胞HCP1表達增強，因而觀察糖皮質(zhì)激素是否能影響肝細胞HCP1的表達和對血紅素的攝取。 （1）肝細胞用不同濃度皮質(zhì)醇預(yù)先處理24h，檢測皮質(zhì)醇對HCP1表達的影響； （2）肝細胞用含皮質(zhì)醇的培養(yǎng)液預(yù)先培養(yǎng)24h，再加入血紅素培養(yǎng)，原子吸收法測定細胞內(nèi)鐵含量，觀察肝細胞HCP1攝取血紅素是否受皮質(zhì)醇影響。 3．葉酸對肝細胞HCP1血紅素攝取的影響 已有的文獻證實，HCP1不僅是血紅素的轉(zhuǎn)運體，同時也是葉酸的轉(zhuǎn)運體（proton-coupled folate transporter，PCFT）。觀察葉酸是否對肝細胞HCP1轉(zhuǎn)運血紅素具有競爭性抑制作用。L02細胞添加葉酸培養(yǎng)，預(yù)先干預(yù)1h，再加血紅素培養(yǎng)2h，原子吸收法檢測細胞內(nèi)鐵含量，推測葉酸對肝細胞HCP1血紅素攝取是否具有抑制作用。 三、鐵含量對肝細胞HCP1表達影響的分子機制探討 在實驗二中我們觀察到不同鐵含量培養(yǎng)的肝細胞以及不同鐵負荷的小鼠肝臟HCP1表達發(fā)生明顯改變。因此，本部分的實驗?zāi)康闹饕翘接戣F含量影響肝細胞HCP1表達的分子機制。 1.篩選可能的轉(zhuǎn)錄因子 已有的研究表明，HCP1/PCFT基因受轉(zhuǎn)錄因子KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等調(diào)控，為了證實鐵含量對HCP1表達的影響是否通過上述轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)，采用離體細胞實驗，通過給予不同的鐵含量培養(yǎng)，檢測KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等轉(zhuǎn)錄因子的表達變化。 2.驗證鐵含量對轉(zhuǎn)錄因子HNF4α表達的影響 通過前一步實驗，篩選到轉(zhuǎn)錄因子HNF4α。采用Western blot法檢測不同鐵含量培養(yǎng)的肝細胞HNF4α蛋白表達變化；采用熒光定量PCR和Western blot法檢測不同鐵營養(yǎng)狀況小鼠肝臟HNF4α mRNA和蛋白表達變化。 3.特異性干擾肝細胞HNF4α表達，檢測鐵含量對HCP1表達的影響 設(shè)計并合成人HNF4α siRNA，轉(zhuǎn)染細胞，PCR方法檢測干擾效果。成功干擾HNF4α表達后，再加去鐵胺DFO，檢測HCP1表達變化。 4.鐵含量對肝細胞HNF4α與HCP1結(jié)合活性的影響 肝細胞采用同上方法建立缺鐵（加DFO）和高鐵（加Holo-transferrin）模型，對照組為正常培養(yǎng)的細胞，采用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測在不同鐵含量培養(yǎng)下肝細胞轉(zhuǎn)錄因子HNF4α與HCP1的結(jié)合活性變化，進一步證實HNF4α在鐵調(diào)節(jié)HCP1表達過程中的重要作用，從而初步闡明肝細胞HCP1表達受鐵含量調(diào)控的分子機制。 四、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 實驗數(shù)據(jù)用(X±S)表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用兩樣本t檢驗和單因素方差分析（one-wayANVOA）進行各組之間的比較。結(jié)果以p0.05為顯著性水平，p0.01為非常顯著性水平。 結(jié)果 一、肝細胞HCP1攝取血紅素功能的觀察 1．肝細胞HCP1表達量測定和細胞株選擇 人肝細胞（L02細胞）和肝癌細胞（HepG2細胞）都明顯表達HCP1，考慮到L02細胞更接近于人正常生理狀態(tài)下的肝細胞，因而主要選擇了L02細胞進行后續(xù)實驗。 2．不同濃度不同時間血紅素培養(yǎng)肝細胞，檢測細胞活性和細胞內(nèi)鐵含量 （1）用濃度為30μM和50μM的血紅素培養(yǎng)肝細胞6小時，用CCK8試劑盒檢測血紅素對細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)30μM血紅素對細胞活性無明顯影響，而50μM血紅素培養(yǎng)的肝細胞活性明顯下降。因而，后續(xù)的實驗都采用不超過30μM濃度的血紅素培養(yǎng)。 （2）不同濃度不同時間血紅素培養(yǎng)的肝細胞，細胞內(nèi)鐵含量隨著血紅素培養(yǎng)濃度以及時間的增加而增加。 （3）用血紅素培養(yǎng)肝細胞12h后，普魯士藍染色發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的鐵顆粒聚集現(xiàn)象。 3.干擾肝細胞HCP1基因，檢測細胞對血紅素的攝取變化 用HCP1siRNA轉(zhuǎn)染L02細胞，熒光定量PCR法檢測HCP1表達顯著下調(diào)，表明肝細胞HCP1基因成功干擾；此時用原子吸收法檢測到細胞對血紅素的攝取也明顯下降。 4.過表達肝細胞HCP1基因，檢測細胞對血紅素的攝取變化 HCP1過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染L02細胞，Real Time PCR法顯示肝細胞HCP1表達顯著上升，表明過表達成功；此時肝細胞對血紅素的攝取也明顯上升。 5.肝細胞用含鋅卟啉的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細胞對鋅卟啉的攝取 用含鋅卟啉的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞6小時，熒光顯微鏡下觀察到肝細胞膜及細胞內(nèi)都有非常明顯的紅色熒光。 肝細胞HCP1基因干擾后，用含鋅卟啉的培養(yǎng)液培養(yǎng)，此時細胞內(nèi)熒光明顯減少；肝細胞HCP1基因過表達后，用含鋅卟啉的培養(yǎng)液培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察到此時細胞內(nèi)熒光明顯增多。 二、肝細胞HCP1血紅素攝取的影響因素探討 1.鐵含量對肝細胞和肝臟HCP1表達的影響 1.1高鐵和缺鐵環(huán)境培養(yǎng)對肝細胞HCP1表達的影響 （1）肝細胞加血紅素培養(yǎng)，細胞內(nèi)的鐵含量增加，此時肝細胞HCP1表達明顯下調(diào)； （2）肝細胞高鐵環(huán)境（加holo transferrin）培養(yǎng)24h，TFR1mRNA表達明顯降低，表明此時細胞內(nèi)鐵濃度高，而此時HCP1mRNA表達也明顯下降； （3）肝細胞缺鐵環(huán)境（加DFO，去鐵胺）和高鐵環(huán)境（holo transferrin）培養(yǎng)24h，細胞HCP1蛋白水平在缺鐵時表達上升，而在高鐵時則表達下降。1.2不同鐵營養(yǎng)狀況小鼠肝臟HCP1的表達變化 （1）參照文獻，建立不同鐵負荷小鼠模型，造模兩周。各組之間小鼠體重?zé)o差異；鐵代謝相關(guān)指標：血清鐵、總鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵飽和度以及肝鐵含量等各組之間均存在明顯差異。 （2）實時熒光定量PCR和western blot法檢測不同鐵營養(yǎng)狀況小鼠肝臟HCP1表達發(fā)現(xiàn)，缺鐵小鼠肝臟HCP1表達明顯上升，而高鐵小鼠HCP1表達則明顯下降。 2.糖皮質(zhì)激素對肝細胞HCP1表達和血紅素攝取的影響 （1）定量PCR和Western blot法結(jié)果顯示，不同濃度的皮質(zhì)醇對肝細胞HCP1表達幾乎無影響。 （2）不同濃度皮質(zhì)醇干預(yù)的細胞再加血紅素培養(yǎng)，原子吸收法檢測細胞內(nèi)鐵含量，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇對肝細胞HCP1轉(zhuǎn)運血紅素幾乎無影響。 3．葉酸對肝細胞HCP1血紅素攝取的影響本實驗用原子吸收法檢測細胞內(nèi)的鐵含量發(fā)現(xiàn)，用葉酸預(yù)先處理過再加血紅素培養(yǎng)的細胞與直接加血紅素培養(yǎng)的細胞，兩組鐵含量無明顯差別；推測葉酸對肝細胞HCP1攝取血紅素可能無影響。 三、鐵含量對肝細胞HCP1表達影響的分子機制探討 1.篩選可能的轉(zhuǎn)錄因子熒光定量PCR法檢測了不同鐵含量培養(yǎng)的L02細胞KLF4、HNF4α、NRF1、YY1等轉(zhuǎn)錄因子的表達變化，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)錄因子HNF4α表達隨著鐵含量改變而改變，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，，而其它幾個轉(zhuǎn)錄因子的表達均無明顯差異。 2.驗證鐵含量對轉(zhuǎn)錄因子HNF4α表達的影響Western blot結(jié)果顯示HNF4α的表達在缺鐵時表達上升，在高鐵時表達下降，與前期HCP1表達變化一致。 定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，缺鐵組小鼠肝臟HNF4α mRNA和蛋白表達水平與對照組比均上升，而高鐵組小鼠肝臟HNF4α mRNA和蛋白表達水平與對照組比均下降，與細胞實驗結(jié)果和前期HCP1表達變化一致。 3.特異性干擾肝細胞HNF4α，檢測鐵含量對HCP1表達的影響PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了HNF4α siRNA的肝細胞，HNF4α mRNA和蛋白表達顯著下降，表明基因干擾成功。此時，細胞再加DFO和Holo-transferrin處理，則細胞HCP1表達水平與對照組比無明顯差異。 4.鐵含量對肝細胞HNF4α與HCP1結(jié)合活性的影響染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）結(jié)果顯示HNF4α在缺鐵時與HCP1結(jié)合活性增強，而在高鐵時HNF4α與HCP1結(jié)合活性則減弱。 結(jié)論 1.采用離體細胞實驗，通過原子吸收、普魯士藍染色、基因干擾、過表達等實驗方法，初步證實肝細胞可以通過HCP1攝取血紅素。 2.肝細胞HCP1攝取血紅素受細胞內(nèi)鐵儲存狀態(tài)的影響，但可能不受皮質(zhì)醇和葉酸的影響。 3.鐵含量對肝細胞HCP1表達的影響可能是通過轉(zhuǎn)錄因子HNF4α實現(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R151.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Ross M Graham;Anita CG Chua;Carly E Herbison;John K Olynyk;Debbie Trinder;;Liver iron transport[J];World Journal of Gastroenterology;2007年35期

2 Adrian R West;Phillip S Oates;;Mechanisms of heme iron absorption:Current questions and controversies[J];World Journal of Gastroenterology;2008年26期

3 吳新剛;彭姝彬;黃謙;;乳腺癌耐藥蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制[J];遺傳;2012年12期

4 Jean-Philippe Babeu;Fran

本文編號：1649386