本文選題：CYP3A1　切入點：BDE47　出處：《南京醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一種溴代阻燃劑,廣泛應用于紡織品、家具、電子和電器產(chǎn)品中。過去的數(shù)年里,PBDEs因在環(huán)境和人體中含量顯著增加而備受關(guān)注。2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether, BDE47)是人體、野生動物和環(huán)境中含量最多的PBDEs同系物。研究表明,BDE47對受試動物具有發(fā)育毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾毒性。人群研究也表明,人血漿中BDE47的濃度與精子運動能力呈負相關(guān),提示BDE47暴露可能損害雄性生殖功能。生物轉(zhuǎn)化是外源化學物在體內(nèi)的重要過程,尤其是親脂性化學物。研究顯示,BDE47可被細胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)(尤其是CYP3A)代謝生成一系列代謝產(chǎn)物,但其在BDE47與生殖毒效應的關(guān)系中的作用尚不明了,其分子機制也不清楚。 本研究通過建立整體或體外BDE47染毒模型,以地塞米松(dexamethasone, DEX, CYP3A1的誘導劑)為工具藥物,通過評估BDE47對CYP3A1的誘導,鑒定其主要代謝產(chǎn)物及活性,分析睪丸生精小管上皮組織形態(tài)改變及生殖細胞凋亡,明確BDE47導致生殖細胞凋亡中的關(guān)鍵信號通路,側(cè)重探討CYP3A1在BDE47所致睪丸毒效應中的作用及分子機制。此外,通過建立高脂飲食(high fatdiet,HFD)條件下BDE47整體染毒模型,評估HFD對BDE47體內(nèi)分布、代謝的影響,分析其對血糖、胰島素、睪酮分泌的影響,探討B(tài)DE47與高脂飲食對CYP3A1的影響及聯(lián)合毒效應,闡明糖脂代謝紊亂與睪丸毒效應的關(guān)系及分子機制。研究結(jié)果將為化學物的生殖毒理學研究提供新的視角和技術(shù)支撐,也為環(huán)境污染物的生殖風險評估、危害控制及預防提供重要參考。 第一部分：CYP3A1的誘導對BDE47所致大鼠睪丸毒效應的影響及分子機制 目的：探討CYP3A1在BDE47的生物轉(zhuǎn)化及其導致的睪丸毒效應中的作用及分子機制。 方法：建立BDE47經(jīng)口灌胃染毒模型,以DEX(CYP3A1的誘導劑)為工具藥,通過分析CYP3A1的表達及活性,檢測血漿、肝臟、睪丸中BDE47的羥基化代謝產(chǎn)物,探討CYP3A1介導的BDE47的生物轉(zhuǎn)化作用；采用流式細胞儀分析BDE47及主要代謝產(chǎn)物3-OH-BDE47對生殖細胞凋亡的影響。此外,運用光鏡在形態(tài)上觀察睪丸生精上皮的破壞,分析生精小管上皮中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成與生精細胞凋亡的關(guān)系,明確關(guān)鍵信號通路在BDE47導致生殖細胞凋亡中的作用,從而較系統(tǒng)地探討CYP3A1在BDE47所致大鼠睪丸毒效應中的作用及分子機制。 結(jié)果：與溶劑對照相比,BDE47能顯著升高大鼠肝臟中CYP3A1的表達及活性,3-OH-BDE47是BDE47的主要代謝產(chǎn)物,且其在血漿、肝臟、睪丸中的含量隨著染毒劑量的增加而增加；DEX與BDE47聯(lián)合處理上述效應顯著增強。此外,隨著BDE47染毒劑量的增加,大鼠睪丸中的3-OH-BDE47及ROS含量逐漸增加,DEX與BDE47聯(lián)合處理3-OH-BDE47及ROS含量顯著增加。與BDE47比較,3-OH-BDE47處理GC-1或者GC-2細胞能產(chǎn)生更多的ROS并通過上調(diào)FAS/FASL, p-p53和cleaved-caspase3介導細胞凋亡,抗氧化劑作用可明顯降低ROS的生成及細胞凋亡。此外,BDE47染毒大鼠生精上皮出現(xiàn)空泡化、生精小管中多核巨細胞增多、TUNEL陽性的生精細胞數(shù)目增加、每日精子生成量下降,并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,而上述效應同樣也被DEX的聯(lián)合處理所加強。 第二部分：高脂飲食條件下CYP3A1對BDE47所致大鼠睪丸毒效應的影響及分子機制 目的：分析高脂飲食對BDE47體內(nèi)分布、代謝以及CYP3A1誘導的影響,探討CYP3A1在BDE47導致的糖脂代謝異常與睪丸毒效應關(guān)系中的作用及分子機制。 方法：建立在正常飲食(normal diet, ND)或高脂飲食(high fat diet, HFD)條件下BDE47整體染毒模型,運用GC-MS檢測血清、肝臟、睪丸中BDE47及其代謝產(chǎn)物,通過檢測血清中葡萄糖、胰島素、睪酮水平以及肝臟病理學改變來評估BDE47染毒對機體糖脂代謝的影響,運用光鏡在形態(tài)上觀察睪丸生精上皮的破壞及附睪中精子密度,采用免疫印跡檢測睪丸中睪酮合成、胰島素受體相關(guān)信號分子的表達,探明高胰島素血癥對Leydig細胞睪酮合成的分子機制。 結(jié)果：HFD能促進BDE47在體內(nèi)的蓄積,其代謝產(chǎn)物含量也顯著增加；BDE47對CYP3A1的表達具有誘導作用,免疫組化進一步證實,這種誘導效應可被HDF所加強。與對照組相比,BDE47能使大鼠血糖、胰島素水平升高、肝臟細胞出現(xiàn)脂肪化,BDE47染毒導致大鼠血清睪酮水平顯著下降、生精上皮出現(xiàn)空泡化、生精小管中多核巨細胞增多,HFD組上述效應更為顯著。BDE47染毒能顯著提高大鼠肝臟中腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNFa)的表達,HFD也能顯著上調(diào)TNFa的上調(diào),BDE47與HFD聯(lián)合處理,TNFα的表達進一步增加。進一步研究發(fā)現(xiàn),BDE47能顯著下調(diào)睪丸中IRS-1、IRβ GLUT-2、GLUT-8的表達；HFD與BDE47聯(lián)合處理IRS-1、IRβ、GLUT-2、GLUT-8進一步下調(diào)。此外,BDE47能顯著下調(diào)睪丸中類固醇激素合成相關(guān)蛋白,StAR、3β-HSD的表達；此外BDE47能顯著上調(diào)DAX-1的表達,提示BDE47能通過上調(diào)DAX-1的表達抑制StAR、3β-HSD的表達,從而使血清睪酮濃度降低,附睪中精子密度降低。 結(jié)論 本次研究成功地構(gòu)建了成年雄性SD大鼠的BDE47/DEX、BDE47/HFD染毒模型,分別從環(huán)境化合物的生物轉(zhuǎn)化及內(nèi)分泌干擾角度出發(fā),探討B(tài)DE47對雄性生殖內(nèi)分泌功能的影響及其分子機制,獲得了一些新的發(fā)現(xiàn)： 1.BDE47能顯著誘導CYP3A1的表達,CYP3A1是大鼠體內(nèi)BDE47的主要代謝酶,3-OH-BDE47是主要的活性代謝產(chǎn)物。 2.BDE47可以使雄性SD大鼠血清睪酮水平降低、生精小管中ROS含量顯著上升、生精細胞發(fā)生凋亡；CYP3A1誘導條件下,BDE47所致的睪丸毒效應明顯,提示CYP3A1在BDE47導致的生殖功能障礙中發(fā)揮了重要作用。 3.高脂飲食可增強BDE47對CYP3A1的誘導作用,這不僅能促進BDE47羥基化代謝產(chǎn)物的生成,還能加劇BDE47導致的糖脂代謝異常,兩者間存在聯(lián)合效應。 4.BDE47導致睪丸毒效應的機制可能同時存在直接和間接兩個途徑。一方面,BDE47被3A1代謝形成的活性代謝產(chǎn)物3-OH-BDE47破壞了血睪屏障導致睪丸中產(chǎn)物的持續(xù)增多,并通過ROS依賴的p53、caspase3、FAS、FASL等多種信號分子參與的細胞凋亡過程誘發(fā)直接毒效應；另一方面,BDE47可通過誘發(fā)糖脂代謝紊亂,產(chǎn)生高胰島素血癥,并通過上調(diào)DAX-1抑制StAR、3β-HSD的表達,導致睪酮合成的抑制,間接影響生殖功能。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【共引文獻】

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1 唐學璽;張t，

本文編號：1639497