本文選題：乙烷亞硝基脲　切入點：小鼠　出處：《揚州大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙烷亞硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)是一種能夠引起基因高效突變的烷化劑,通過使用ENU誘導(dǎo)小鼠突變的手段,經(jīng)過篩選可獲得大量具有突變表型的G1代小鼠,用于基因功能的研究及人類疾病動物模型的建立。 通過ENU誘導(dǎo)小鼠突變,我們獲得一種瞳孔散大小鼠,研究發(fā)現(xiàn)該突變表型是由Nrg1基因突變引起,藥理及免疫組化實驗表明該突變導(dǎo)致小鼠瞳孔括約肌上M受體減少。該小鼠被命名為NrglmlYzcm (neuregulin1; mutation l,Yangzhou University Comparative Medicine Center, hereafter Dp1)。遺傳實驗表明突變雜合子小鼠瞳孔散大表型外顯率極低,而純合子小鼠外顯率為100%。本研究工作分為以下五個部分： 1ENU誘變獲得一種瞳孔散大小鼠 通過ENU誘導(dǎo)小鼠突變手段獲得一種瞳孔部分散大雜合子小鼠,當(dāng)用光線照射小鼠眼球時,該小鼠瞳孔對光線無明顯反射現(xiàn)象(無明顯收縮)。 將瞳孔散大雜合子小鼠與正常B6小鼠配種后共觀察并記錄115只后代小鼠,其中3只小鼠出現(xiàn)單側(cè)且部分瞳孔散大表型；將瞳孔散大雜合子互交,觀察并記錄34只后代,共有5只后代小鼠表現(xiàn)為瞳孔散大表型,其中1只小鼠表現(xiàn)為單側(cè)且部分瞳孔散大表型,4只小鼠表現(xiàn)為雙側(cè)且嚴(yán)重瞳孔散大表型；4只雙側(cè)且嚴(yán)重瞳孔散大表型小鼠互交后代全部表現(xiàn)為瞳孔散大表型。 2瞳孔散大突變基因的定位 在初步染色體定位過程中,采用B6背景瞳孔散大突變小鼠與C3H或D2小鼠配種獲得的F1代小鼠,并將F1代小鼠與B6背景野生型小鼠回交獲得的N2代突變小鼠配種方案繁殖用于定位小鼠。定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)在25個N2瞳孔散大小鼠樣品中突變基因與微衛(wèi)星D8mit171(距著絲粒11.43cM)和D8mit4(距著絲粒18.89cM)均未發(fā)生交換,從而確定該突變基因位于小鼠第8號染色體D8mit171和D8mit4之間(或附近)。另外突變基因與其他染色體上所選微衛(wèi)星均無明顯連鎖。 由于以上配種方案獲得具有突變表型的N2代小鼠的外顯率極低。在精確定位過程中改用將瞳孔散大突變小鼠與D2或C3H小鼠配種得到F1代,再將Fl代小鼠互交獲得F2代突變小鼠方案進行定位。結(jié)果共獲得118只F2代突變小鼠,最終將瞳孔散大突變基因定位于遺傳標(biāo)記rs32829041(單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記)與D8Mit4之間,兩標(biāo)記間距離約1.52Mb。在此區(qū)間目前已報道Dusp26, Rnfl22, BC019943, Mak16, Fut10,7420700N18Rik, Snord13,Mir1186, Nrg1共9種基因,但無相關(guān)基因突變引起瞳孔散大異常表型的相關(guān)報道。 3瞳孔散大突變基因的克隆與序列分析 對上述9種基因分別進行測序分析。序列比對結(jié)果顯示Dusp26、Mir1186、 Rnf122、Snordl3、BC019943、Mak16、Fut10、7420700N18Rik序列與數(shù)據(jù)庫或本中心B6小鼠相應(yīng)基因序列一致,基本排除這些基因的突變引起Dp1小鼠瞳孔散大表型的可能。在對Nrg1基因測序分析后發(fā)現(xiàn)在Nrg1外顯子E59(該外顯子編碼NRG1蛋白EGFβ結(jié)構(gòu)域)后第5個堿基處發(fā)生G到A的轉(zhuǎn)換。 由于瞳孔散大小鼠G到A的堿基突變位于mRNA剪接供體位點,推測該突變可能影響剪接體對該位點剪接能力,從而引起Dp1小鼠瞳孔散大表型。為了證實以上設(shè)想,設(shè)計分別擴增Ig及CRD型Nrg1局部序列的引物(擴增區(qū)域包含突變位點)。通過RT-PCR方法,分別從瞳孔散大及野生型B6小鼠腦組織總RNA中擴增相應(yīng)片段,RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示對瞳孔散大及野生型B6小鼠Ig及CRD型Nrg1基因分別擴增出3個條帶(band a、band b、band c)。其中band b對應(yīng)于β1-type EGF Nrgl,該類型Nrgl在大腦中高度表達(dá)。定量分析結(jié)果表明與野生型小鼠相比突變純合子小鼠Nrg1的CRD及Ig型Nrg1中band b基因表達(dá)量僅分別為野生型小鼠的42.6%和32.8%。 對野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型條帶a直接測序表明：野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型4種a條帶測序信號圖都出現(xiàn)明顯的重疊信號。對野生型B6小鼠Ig型及CRD型b條帶直接測序表明：所測序列測序信號無明顯重疊,序列分別對應(yīng)于CRD-β1和Ig-β1Nrg1基因序列,而對瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型條帶b測序都出現(xiàn)明顯的重疊信號。對野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型c條帶測序結(jié)果表明：1)野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型c帶序列一致,野生型B6和瞳孔散大小鼠CRD型c帶序列一致；2)與對應(yīng)野生型B6小鼠b條帶相比c條帶缺少外顯子E59和E24對應(yīng)序列共83個堿基,該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物目前尚未有文獻(xiàn)報道。 將以上RT-PCR產(chǎn)物直接測序出現(xiàn)重疊信號的條帶進行T-A克隆后進一步測序分析,結(jié)果顯示：所有所測序的野生型B6克隆的mRNA模板在剪接過程中,剪接體在外顯子E59后發(fā)生剪接；而由于G到A堿基突變,削弱剪接體對該剪接位點的剪接能力,從而絕大多數(shù)測序的嚴(yán)重瞳孔散大小鼠克隆的mRNA模板在剪接過程中,剪接體未對緊接外顯子E59后的剪接位點進行剪接,部分克隆序列顯示剪接體對其他潛在的剪接位點進行了剪接。所以在測序的克隆中存在部分克隆不包含外顯子E59、部分克隆存在正常情況下尚未檢測到得“異�！奔艚铀a(chǎn)生的外顯子、剪接體跳過緊接外顯子E59后剪接位點而對其后潛在的剪接位點進行剪接等結(jié)果。蛋白預(yù)測表明突變引起部分EGFβ-type Nrg1蛋白的減少,并被部分EGF a-type Nrg1蛋白代替。 4Nrg1基因突變對瞳孔括約肌毒蕈堿受體表達(dá)的影響 單獨使用毛果蕓香堿眼藥水滴眼后,瞳孔散大純合子及瞳孔部分散大雜合子小鼠瞳孔大小無明顯變化。單獨使用新斯的明或與毛果蕓香堿聯(lián)合對瞳孔散大純合子滴眼后,瞳孔散大純合子小鼠瞳孔大小無明顯變化。毛果蕓香堿、新斯的明腹腔注射后,瞳孔散大純合子小鼠瞳孔大小無明顯變化,但注射后小鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重的流涎及輕度流淚反應(yīng)。阿托品腹腔注射瞳孔部分散大雜合子小鼠后,小鼠瞳孔出現(xiàn)完全散大表型。以上結(jié)果顯示,瞳孔散大小鼠括約肌上M受體可能減少,且雜合子小鼠M受體比純合子數(shù)量多,其M受體經(jīng)過阿托品的封閉后,使得肌肉不能收縮。肌肉收縮程度在一定范圍內(nèi)與神經(jīng)遞質(zhì)(配體)與受體數(shù)量有關(guān)。過量的神經(jīng)遞質(zhì),但有限的受體同樣不能使瞳孔散大雜合子小鼠括約肌完全收縮。 膽堿型受體可分為煙堿型受體(Nicotinic Acetylcholine receptor,N受體)和毒蕈堿型受體(Muscarinic Acetylcholine receptor,M受體)兩大類。M受體分為M1-M5五個亞型,括約肌上受體屬于M受體且其中以M3受體為主,M3基因敲除小鼠表現(xiàn)為部分瞳孔散大表型。文獻(xiàn)報道Nrg1對神經(jīng)-骨骼肌接頭處骨骼肌表面N受體具有聚集作用。為進一步驗證瞳孔散大小鼠瞳孔括約肌上M受體減少的可能,使用免疫組化技術(shù)對括約肌上M3受體進行分析,結(jié)果顯示與野生型小鼠相比Dp1/Dp1小鼠瞳孔括約肌上M3受體分布明顯減少。 5瞳孔散大小鼠模型的遺傳特性 在使用酶切進行基因分型基礎(chǔ)上,將Nrg1突變雜合子(Dp1/+)互交,Nrg1突變純合子(Dp1/Dp1)與突變雜合子(Dp1/+)配種,將Nrg1突變純合子(Dp1/Dp1)與野生型小鼠(+/+)配種,將Nrg1突變純合子(Dp1/Dp1)互交,分別記錄后代正常與瞳孔散大表型小鼠的數(shù)目(包括散大嚴(yán)重程度)及對應(yīng)的基因型。結(jié)果表明所有突變純合子小鼠表現(xiàn)為瞳孔散大表型,而雜合子小鼠瞳孔散大表型外顯率極低(5/111)。 另外Dpl/+×Dp1/+配種后代小鼠基因型Dp1/Dp1:Dp1/+:+/+為16：63：29,與孟德爾遺傳理論比1：2：1不符(0.01P0.05),提示存在部分純合子小鼠死亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R-332;R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1631671