本文選題：阿特拉津降解菌　切入點：三嗪水解酶　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：阿特拉津（atrazine），商品名莠去津，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛使用的三嗪類除草劑。由于其在環(huán)境中穩(wěn)定存在，不易降解，造成了生態(tài)環(huán)境的破壞，威脅到人類食品及飲用水的安全。阿特拉津降解菌株根據(jù)其降解基因的組成，可以分為三種類型，分別是atzABCDEF、trzN-atzBC和atzABC-trzD。trzN基因所編碼的酶是trzN-atzBC降解途徑中降解阿特拉津的第一個酶，稱為三嗪水解酶。trzN基因比atzA基因在阿特拉津降解菌中更加普遍，并且具有更廣的底物譜。因此，阿特拉津降解菌株中trzN基因的生物學(xué)功能具有重要的研究價值。 目的： 通過對四株阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶基因trzN的比較研究，加深對trzN基因生物學(xué)功能的認識，為生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展提供理論儲備。 方法： 1三嗪水解酶TrzN的表達與純化 1.1表達載體和菌株的構(gòu)建：用PCR方法擴增出三嗪水解酶基因trzN，連接至高效表達載體pET-28b(+)上，轉(zhuǎn)化入E. coli BL21(DE3)，并添加分子伴侶。 1.2表達條件的優(yōu)化：選擇合適的L-(+)-Arabinose濃度、生長溫度和IPTG濃度，優(yōu)化表達條件，增加可溶性蛋白比例。 1.3保存條件的優(yōu)化：選擇最適的緩沖液、最適pH值以及緩沖液的濃度，最大限度的保存蛋白活性。 1.4純化條件的優(yōu)化：根據(jù)親和層析的方法，用不同濃度咪唑洗脫緩沖液洗脫TrzN蛋白，純化目的蛋白。 2三嗪水解酶TrzN酶學(xué)性質(zhì)的比較研究 2.1最適反應(yīng)條件的研究：測定蛋白活性與溫度、pH值以及金屬離子之間的關(guān)系。 2.2底物特異性的研究：研究TrzN降解不同底物的能力。 3酶動力學(xué)常數(shù)測定：測定并計算TrzN的K_m值和V_max值。 4三嗪水解酶TrzN在阿特拉津降解菌株中的分布：為了在蛋白水平上進一步確定篩選得到的阿特拉津降解菌株中是否含有trzN基因編碼的三嗪水解酶TrzN，進行了western blot檢測。我們將構(gòu)建好的表達載體pET-21b(+)-trzN轉(zhuǎn)化入E. coli BL21表達菌株中（trzN基因來自節(jié)桿菌TC1），制備兔多克隆抗體。用制備好的trzN抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記羊抗兔作為二抗，對各阿特拉津降解菌株進行western blot檢測。 結(jié)果： 1三嗪水解酶TrzN的表達與純化 1.1表達載體和菌株的構(gòu)建：根據(jù)雙酶切和基因測序結(jié)果證明高效表達載體pET28b(+)-trzN構(gòu)建成功。 1.2TrzN的最適表達條件為：表達菌株生長至OD_(600)約為0.5時加入L-(+)-Arabinose至終濃度為0.015%，誘導(dǎo)表達1.5h，分別加入IPTG至終濃度1.5μmol·L~(-1)，15℃誘導(dǎo)表達16h，可溶蛋白表達量最大。 1.3TrzN的最適保存條件為：TrzN粗酶液在pH8.0的50mmol·L~(-1)磷酸鉀緩沖液中酶活力的保持最好。 1.4純化條件的優(yōu)化：在咪唑濃度為200mmol·L~(-1)時目標蛋白被大量洗脫，并且不含雜蛋白。 2三嗪水解酶TrzN酶學(xué)性質(zhì)的比較研究 2.1最適反應(yīng)條件的研究：TrzN純酶酶反應(yīng)的最適pH值為8.0，，其在pH8.0的中性環(huán)境中比較穩(wěn)定；TrzN純酶在室溫至30℃之間比較穩(wěn)定，放置30min后酶活力降低較少，在40~50℃放置30min酶活力降低明顯，在70℃放置30min酶完全失活；經(jīng)研究表明Co~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)對TrzN有激活作用，特別是Co~(2+)對酶的激活作用明顯，Cu~(2+)和Ni~(2+)對酶有輕微抑制作用，使TrzN活性減弱。 2.2底物特異性的研究：TrzN酶有多底物活性，對ametryn的降解活性最高，dipropetry次之，而對prometryne、atratone和atrazine的降解活性相對較低。 3TrzN的酶動力學(xué)常數(shù)：四種不同阿特拉津降解菌株三嗪水解酶TrzN的K_m值和V_max值非常相近。米氏常數(shù)（K_m）和最大反應(yīng)速度（V_max）分別約為42±10μmol·L~(-1)，172±10μmol·L~(-1)min~(-1)。4TrzN在阿特拉津降解菌中得分布：除Pseudomonas sp. ADP不能與TrzN蛋白抗體相結(jié)合外，其余25株阿特拉津降解菌株均與TrzN蛋白抗體發(fā)生免疫熒光反應(yīng)。 結(jié)論： 1這四株阿特拉津降解菌株所表達的TrzN蛋白，降解活性無明顯差異。 2除Pseudomonas sp. ADP不含有TrzN蛋白外，其余25株阿特拉津降解菌株中均含有TrzN蛋白。
[Abstract]:Atala Zin (atrazine), the commodity name of atrazine, is a widely used in the world within the scope of three triazine herbicides. Because of its stability in the environment, not easy to be degraded, resulting in the destruction of the ecological environment, the threat to human food and drinking water safety. Atala Zin Degradation Strain according to the composition of the degradation genes which can be divided into three types, namely atzABCDEF, trzN-atzBC and atzABC-trzD.trzN gene encoding the enzyme is the first enzyme degradation of Atala Zin trzN-atzBC in the degradation pathway, called three triazine hydrolase.TrzN gene than the atzA gene in a atrazine degrading bacteria is more common, and has a broad substrate spectrum. Therefore, biology the function of trzN gene in Atala Zin degrading strains has important research value.
Objective:
A comparative study of three azine hydrolase gene trzN in four atrazine degrading strains was made to deepen the understanding of trzN gene's biological function and provide theoretical reserve for the development of bioremediation technology.
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本文編號：1610828