本文選題：砷　切入點：HaCaT細胞　出處：《新疆醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:NRF2基因抑制的人角質(zhì)形成細胞株HaCa T細胞為模型細胞,阻滯NRF2對NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關(guān)系,為砷致皮膚毒性機制提供理論依據(jù)。方法:1、NRF2 shRNA的構(gòu)建:以人源NRF2基因為靶基因,設計與NRF2基因具有特異性的小干擾RNA,構(gòu)建其shRNA,重組慢病毒表達載體,并進行測序鑒定。2、慢病毒包裝:用重組后表達成功的載體轉(zhuǎn)染并包裝細胞293T,收集、濃縮病毒上清液、測定其滴度。3、抑制NRF2基因的Hacat細胞模型的構(gòu)建,構(gòu)建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細胞(MOI=5),感染48小時后,用1μg/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株。4、穩(wěn)定細胞株的鑒定:篩選出穩(wěn)定的細胞株后,用實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)檢測干擾效率。5、細胞培養(yǎng)與砷處理:所用細胞均按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。6、MTT法檢測細胞生長狀況,確定砷處理濃度,砷處理濃度別為以毒理學標準的LC50的1/100、1/50、1/10。7、流式細胞儀檢測細胞活性氧。8、實時熒光定量PCR檢測細胞中Nrf2、KEAP1、N6AMT1、Bach1、MAPK/ERK mRNA的表達水平。9、ELISA法檢測細胞中GSH、N6AMT1、COX-2的蛋白表達水平。結(jié)果:1、慢病毒干擾載體構(gòu)建測序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。2、慢病毒滴度測試結(jié)果:依據(jù)滴度(TU/ml)=細胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×103選取最佳滴度的病毒。3、選取NRF2 shRNA3 Hacat細胞,其基因的抑制效率為87%。4、砷處理低、中、高劑量組分別為2.10μmol/L、4.20μmol/L、21.00μmol/L,抑制Nrf2、抑制Keap1、空白對照組砷處理濃度為0μmol/L。5、細胞增殖:2.10μmol/L砷處理細胞,細胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象;4.20μmol/L砷處理細胞在72h開始出抑制;21.00μmol/L砷處理細胞48h開始明顯抑制細胞�？瞻捉M細胞增值率略低于抑制Keap1對照組,高于抑制Nrf2對照組。6、活性氧(ROS)在空白組表達較高隨時間變化趨向穩(wěn)定,抑制Keap1基因ROS表達上調(diào),抑制Nrf2基因ROS降低,砷處理后ROS下調(diào)。7、2.10μmol/L、4.2μmol/L砷處理抑制Nrf2基因的細胞8h、24h后促進Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA的表達;21.00μmol/L砷處理72h可使抑制Nrf2基因的細胞中Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。8、2.10μmol/L、24h砷處理的抑制NRF2基因的HaCaT細胞能使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達上調(diào);72h、29.00μmol/L砷處理抑制NRF2基因的HaCaT細胞使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);結(jié)論:1、砷具有低促效應。2、N6AMT1能夠調(diào)控氧化與抗氧化水平。3、GSH調(diào)節(jié)細胞氧化水平。4、ROS在體內(nèi)有維持動態(tài)平衡。5、Bach1、COX-2能夠參與抗氧化反應。6、MAPK/ERK會激活COX-2的表達。
[Abstract]:Objective to block the effect of NRF2 on NRF2 inhibitory factor and its relationship with MAPK gene in human keratinocyte line HaCa T cell line (HaCa T cell line), which is inhibited by 1: NRF2 gene. Methods: human NRF2 gene was used as target gene to design small interference RNAs specific to NRF2 gene and construct its shRNAs and recombinant lentivirus expression vector. DNA sequencing was performed to identify lentivirus packaging: the recombinant vector was successfully transfected and packaged into 293T, then the supernatant of virus was collected and concentrated, the titer of the supernatant was determined, and the Hacat cell model of inhibiting NRF2 gene was constructed. After 48 hours of infection, stable cell line. 4 was screened with 1 渭 g / ml purine mycin, and the stable cell line was identified. The interference efficiency. 5, cell culture and arsenic treatment were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(Real-Time Quantitative. All the cells were cultured according to the conventional cell culture method. The growth status of the cells was detected by using the method of cell culture, and the concentration of arsenic treatment was determined. Arsenic concentration was measured as 1 / 100 / 1 / 50 / 10.7 of LC50 according to toxicological standard. Reactive oxygen species was detected by flow cytometry. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression level of MAPKERK mRNA in cells. 9 Elisa was used to detect the expression of COX-2 protein in cells with GSHN6AMT1. The results showed that the expression level of COX-2 was detected by Elisa. The construction and sequencing of the virus interference vector showed that the recombinant vector was successfully constructed. The results of lentivirus titer test were as follows: according to the titer of NRF2 shRNA3 Hacat cells, the best titer of virus was selected according to the titer tu / ml = the number of cells 脳% 脳 moi 1) 脳 virus dilution times 脳 103, and NRF2 shRNA3 Hacat cells were selected. The inhibition efficiency of its gene was 87.4.The low arsenic treatment, the medium and high dose groups were 2.10 渭 mol / L ~ 4.20 渭 mol / L ~ 4.20 渭 mol 路L ~ (-1) 路L ~ (-1), respectively, which inhibited Nrf2 and Keap1. The arsenic concentration of control group was 0 渭 mol / L 路L ~ (5), and the proliferation of arsenic treated cells was 2.10 渭 mol / L ~ (-1). The proliferation of arsenic treated with 4.20 渭 mol/L began to inhibit 21.00 渭 mol/L arsenic treatment at 72 h, and the cell proliferation rate of the blank group was slightly lower than that of the control group, and the proliferation rate of the cells in the blank group was slightly lower than that in the control group. Compared with the control group, the expression of Ros in the blank group tended to be stable, the expression of Keap1 gene ROS was up-regulated, and the Nrf2 gene ROS was decreased, and the expression of Ros was higher than that of the control group (P < 0.05). After arsenic treatment, ROS down-regulated 2.10 渭 mol / L ~ (4.2) 渭 mol 路L ~ (-1) of arsenic and inhibited Nrf2 gene expression in cells treated with arsenic for 8 h and 24 h. After treatment with arsenic, the expression of MAPK / ERK was increased by 21.00 渭 mol/L arsenic treatment, and the expression of Bach1N6AMT1MAPK-ERK / ERK mRNA was down-regulated in Nrf2 cells. There was significant difference in the expression of NRF2 gene in HaCaT cells treated with 2.10 渭 mol / L ~ 2.10 渭 mol 路L ~ (-1) P0.001 路L ~ (-1) 路L ~ (-1) 路L ~ (-1) 路L ~ (-1) for 24 h. The expression of N6AMT _ (1) -COX-2GSH protein was up-regulated in HaCaT cells treated with arsenic (29.00 渭 mol/L), and the expression of N6AMT1-COX-2GSH protein was down-regulated in HaCaT cells treated with arsenic (29.00 渭 mol / L). Conclusion: 1: 1, arsenic has low promoting effect. 2N6AMT1 can regulate oxidation and oxidation. 3GSH can regulate cell oxidation level. 4 Ros maintain dynamic balance. 5 Bach1 COX-2 can participate in the antioxidant response. 6MAPK / ERK can activate COX-2 expression.
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;基因沉默臨床研究獲成功[J];臨床合理用藥雜志;2010年11期

2 李新發(fā);;一切基因說了算?[J];科學與文化;2006年07期

3 克萊夫·庫克森;;【英國(金融時報)文章】題:讓壞基因沉默[J];中國洗滌用品工業(yè);2003年02期

4 房師松,鄧平建,趙樹進;基因沉默機制與預防對策[J];衛(wèi)生研究;2004年04期

5 陳雪梅,杜顯剛,譚志巍,王亞琴,官鵬;基因沉默的研究進展[J];法律與醫(yī)學雜志;2005年03期

6 字友梅;王少元;;新基因功能的研究策略[J];醫(yī)學綜述;2011年10期

7 湯富酬,李成建,薛友紡;雙鏈RNA在基因沉默中的作用[J];中國生物化學與分子生物學報;2002年06期

8 卞曉翠;劉玉琴;;基因功能的抑制[J];中華病理學雜志;2006年05期

9 佟雨;;解開“基因鋼琴”彈奏之謎[J];自然與科技;2011年04期

10 劉春喜;壽命相關(guān)基因與衰老的生化機制[J];生理科學進展;2004年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 袁誠;李萃;馬金;韓成貴;于嘉林;Andrew Jackson;李大偉;;大麥條紋花葉病毒誘導的基因沉默載體系統(tǒng)的改造及其應用[A];中國植物病理學會2009年學術(shù)年會論文集[C];2009年

2 陳翔;;RNAi:從科學家的剪九到醫(yī)師的治療手段[A];中華醫(yī)學會第十二次全國皮膚性病學術(shù)會議論文集[C];2006年

3 施定基;張文俊;鄧元告;冉亮;康瑞娟;趙興貴;張越南;;藻類基因工程的一些進展[A];中國海洋生化學術(shù)會議論文薈萃集[C];2005年

4 王海光;李自超;;植物干旱脅迫應答基因及其產(chǎn)物研究進展[A];2003年全國作物遺傳育種學術(shù)研討會論文集[C];2003年

5 陳愛葵;李梅紅;;RNAi—基因沉默[A];遺傳學進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

6 項曉瓊;;RNAi技術(shù)在毒理學中的應用[A];中國藥理學會毒理專業(yè)委員會第十次學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

7 劉家云;郝曉柯;李慶霞;馬龍洋;溫偉紅;賈林濤;楊安鋼;;靶向X區(qū)的siRNA抑制HBV基因的表達和復制[A];第九屆西北五�。▍^(qū)）檢驗醫(yī)學學術(shù)會議論文匯編[C];2005年

8 焦鋒;樓程富;;基因在植物多倍體中的進化研究進展[A];中國蠶學會第三屆青年學術(shù)研討會暨浙江省第二屆青年學術(shù)論壇——蠶桑分論壇論文集（上冊）[C];2001年

9 吳麗娟;陳偉;康格非;蔣建新;朱佩芳;;鋅指蛋白A20基因沉默載體研究與初步應用[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

10 徐新云;毛侃瑯;毛吉炎;;CYP3A4基因沉默和高表達對三氯乙烯致肝細胞毒性的影響[A];中國毒理學會第六屆全國毒理學大會論文摘要[C];2013年

相關(guān)重要報紙文章 前9條

1 Esha Dey Pallavi Ail 編譯 碩軍;“基因沉默”先導者[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2013年

2 南方日報記者 張勝波　林亞茗 通訊員 粵科宣;“廣東是成果產(chǎn)業(yè)化好地方”[N];南方日報;2011年

3 記者 李荔;朱冰：環(huán)境也可以改變基因[N];北京科技報;2012年

4 記者 毛黎;科學家成功解開大量基因沉默之謎[N];科技日報;2008年

5 醫(yī)學博士 科學松鼠會成員 致樺;美麗的干擾[N];中國經(jīng)營報;2010年

6 紀光偉;2006,最出彩的是基因[N];健康報;2006年

7 張?zhí)锟?基因編輯器被寄予厚望[N];中國醫(yī)藥報;2014年

8 張?zhí)锟?垃圾DNA并非垃圾[N];文匯報;2012年

9 記者　許琦敏;基因“梁祝悲劇”誘發(fā)血癌[N];文匯報;2007年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 張興坦;煙草MAPK基因的功能研究[D];重慶大學;2015年

2 Chabungbam Orville Singh（奧維爾）;家蠶BmPLA2和BmRab3基因的分子克隆、表達和功能研究[D];浙江大學;2014年

3 穆春;棉花耐鹽基因篩選及酪氨酸蛋白磷酸酶基因功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2016年

4 蘇思遠;組織蛋白酶D基因沉默誘導HeLa細胞老化的機制研究[D];中國科學院北京基因組研究所;2016年

5 王鵬飛;玉米、小麥的胚與胚乳DNA甲基化差異研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

6 李武;鹽脅迫下陸地棉根蛋白差異表達分析及耐鹽相關(guān)基因的功能鑒定[D];河南大學;2016年

7 吳欣玉;豬Prdx6和Prdx2基因功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2016年

8 劉曉蕊;成纖維細胞生長因子受體4基因沉默對胃癌生物學功能影響的研究及其臨床意義[D];鄭州大學;2015年

9 高慧慧;潛伏相關(guān)基因UL138在人巨細胞病毒潛伏—激活中的調(diào)控及機制[D];浙江大學;2015年

10 李正鵬;蘋果樹腐爛病菌效應基因的鑒定及其致病功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 劉炎霖;水茄（Solanum torvum）StUBCc基因的克隆及功能初步分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 劉凱;棉花抗黃萎病相關(guān)基因GhSKIP35基因的克隆與功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

3 任夢飛;靈芝細胞懸浮培養(yǎng)中高表達靈芝鯊烯合酶基因提高靈芝酸單體的生產(chǎn)[D];昆明理工大學;2015年

4 梁甜;白樺OSC新基因的克隆、RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化初步研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

5 劉春娟;84K楊HDA903基因的克隆與功能分析[D];東北林業(yè)大學;2015年

6 胡亞平;Peroxiredoxin Ⅰ基因沉默對TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖及膠原合成影響的實驗研究[D];河北聯(lián)合大學;2014年

7 蘇靜芬;慢病毒介導恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

8 王素艷;殘緣璃眼蜱subolesin和半胱氨酸蛋白酶基因生物學功能初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

9 向婷;滲透壓脅迫下AM真菌Rhizophagus irregularis HOG1基因的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 宋雪;利用CRISPR/Cas9和TALENs技術(shù)敲除斑馬魚Vap、C1H7orf55、mri1、BX284640.3和dscr6基因[D];山東大學;2015年

，

本文編號：1573301