本文關(guān)鍵詞： TDCIPP DGE PI3K/Akt信號通路 細(xì)胞凋亡　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)作為一種新型環(huán)境有機(jī)污染物受到了研究者的廣泛關(guān)注,其生產(chǎn)量和使用量一直處于較高水平且呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。TDCIPP作為添加劑應(yīng)用于紡織、家具、電子產(chǎn)品、嬰幼兒產(chǎn)品等各行各業(yè)中,可經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)化過程逐漸滲入到環(huán)境介質(zhì)中。環(huán)境及生物監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn),在水、室內(nèi)外空氣、土壤、灰塵等環(huán)境介質(zhì)中,甚至魚類、鳥類等生物體內(nèi)均檢測到不同濃度范圍的TDCIPP,有些樣本中的含量甚至超越了溴代聯(lián)苯醚的水平。人類可通過攝食、吸入及皮膚吸收等多種途徑暴露TDCIPP,目前已經(jīng)在人類的尿液、乳汁以及胎盤中都檢測到TDCIPP及其代謝產(chǎn)物的存在。因此,評價TDCIPP潛在的毒性以及對環(huán)境健康的影響已經(jīng)刻不容緩。已有研究表明,TDCIPP能夠?qū)Σ溉轭悇游锂a(chǎn)生甲狀腺內(nèi)分泌干擾毒性以及潛在的神經(jīng)毒性。本研究以多巴胺能神經(jīng)元模型(PC12細(xì)胞)為受試對象,初步探討TDCIPP的毒性效應(yīng)以及可能的分子機(jī)制。目的建立有機(jī)磷酸酯阻燃劑TDCIPP致PC12細(xì)胞損傷模型,并觀察TDCIPP暴露產(chǎn)生的毒性效應(yīng);應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)測序技術(shù)篩選TDCIPP暴露致PC12細(xì)胞損傷的差異表達(dá)基因并加以驗(yàn)證,進(jìn)而探討TDCIPP致PC12細(xì)胞損傷的毒性作用機(jī)制。為評價TDCIPP毒理學(xué)機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。方法1、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)評估:1.1、實(shí)驗(yàn)分組及處理:分化的PC12細(xì)胞分為5組:(1)正常對照組(Control組):含有細(xì)胞的培養(yǎng)液;(2)TDCIPP暴露組,暴露劑量為7.5,15,30,60?M,共4組。每組設(shè)置3-6個復(fù)孔。1.2、TDCIPP對PC12細(xì)胞生存率的影響:培養(yǎng)PC12細(xì)胞并刺激分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞,按實(shí)驗(yàn)分組分別暴露TDCIPP 24 h和72 h,采用CCK-8法檢測TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞生存率的影響,并確定TDCIPP的暴露時間;1.3、TDCIPP對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響:分化的PC12細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組暴露TDCIPP 72 h,采用分子探針DCFH-DA試劑盒,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。1.4、TDCIPP對PC12細(xì)胞凋亡的影響:分化的PC12細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組暴露TDCIPP 72 h,采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;并利用Western blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)量。2、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞毒性作用機(jī)制的研究:2.1、實(shí)驗(yàn)分組及處理:用于DGE測序分析的實(shí)驗(yàn)分組為:正常對照組(C組)以及60?M TDCIPP暴露組(H組);用于qRT-PCR以及Western blot檢測的實(shí)驗(yàn)分組同1.1小節(jié);暴露時間均為72 h,每個實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個復(fù)孔。2.2、分化的PC12細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組暴露TDCIPP后,運(yùn)用DGE測序技術(shù)檢測PC12細(xì)胞mRNA表達(dá)情況,篩選出差異表達(dá)的基因,并通過GO富集和KEGG富集尋找可能的代謝通路產(chǎn)生的影響;2.3、分化的PC12細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行TDCIPP暴露處理,選取6個顯著表達(dá)的差異基因(Myc、p21、Lamb3,col1a1,THBS和CREB),運(yùn)用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證DGE測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性;2.4、分化的PC12細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行TDCIPP暴露處理,采用Western blot技術(shù)檢測PC12細(xì)胞中磷酸化PI3K/Akt及非磷酸化PI3K/Akt/Myc/p21蛋白的表達(dá)量。結(jié)果1、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)評估:1.1、TDCIPP對PC12細(xì)胞生存率的影響:不同劑量的TDCIPP暴露PC12細(xì)胞24 h、72 h后,細(xì)胞的生存率均隨暴露劑量的升高而降低,呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系;在相同的暴露劑量下,72 h暴露所致細(xì)胞生存率的降低程度高于24 h暴露;當(dāng)TDCIPP劑量為60μM、暴露72 h時,細(xì)胞存活率為(58.15?0.78)%,接近半數(shù)致死濃度,故選取72 h作為暴露時間;1.2、TDCIPP對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響:與對照組相比,TDCIPP暴露組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量呈上升趨勢,且在30,60μM劑量時具有顯著性差異(P(27)0.01);SOD與GSH的含量隨TDCIPP暴露劑量的升高而降低;MDA含量則呈現(xiàn)升高的趨勢;1.3、TDCIPP對PC12細(xì)胞凋亡的影響:與對照組相比,TDCIPP暴露組細(xì)胞凋亡率明顯升高,呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系,在15,30,60μM暴露組所致細(xì)胞凋亡率的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義(P(27)0.01),且在最高暴露劑量60μM時,細(xì)胞的凋亡率增加了5.7倍;抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降,而促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高,Bcl-2/Bax的相對比值則隨著TDCIPP暴露濃度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢,且各暴露組與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞毒性作用機(jī)制的研究:2.1、DGE測序數(shù)據(jù)顯示:每個樣本的數(shù)據(jù)量均大于3.27G,滿足生物信息分析的需要;每個樣本的數(shù)據(jù)與參考基因比對結(jié)果均在85%以上,說明測序深度和廣度很好;共篩選出161個差異表達(dá)的基因,其中49個基因上調(diào),112個基因下調(diào)。GO富集和KEGG富集分析結(jié)果顯示,TDCIPP暴露于PC12細(xì)胞后,差異基因多涉及羧酸代謝、氨基酸代謝、PI3K/Akt信號通路及細(xì)胞外基質(zhì)受體等調(diào)控通路;2.2、所選取的6個基因的mRNA相對表達(dá)量,與DGE測序結(jié)果變化趨勢相一致;將選取的6個基因的qRT-PCR結(jié)果與DGE測序結(jié)果進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)以及簡單線性回歸分析,結(jié)果顯示:皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.801,且P值小于0.01,兩者結(jié)果呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性;決定系數(shù)R2=0.642,這表明DGE測序結(jié)果能較好的代表qRT-PCR檢測結(jié)果。以上結(jié)果表明DGE測序得到的差異表達(dá)基因結(jié)果可信,能夠很好的體現(xiàn)TDCIPP暴露后,對PC12細(xì)胞基因的變化情況,以及隨之可能引起的毒性效應(yīng);2.3、TDCIPP暴露PC12細(xì)胞后,PI3K/Akt的磷酸化水平呈現(xiàn)濃度依賴性的降低,非磷酸化水平在各劑量的暴露下均無統(tǒng)計學(xué)改變;Myc mRNA與蛋白表達(dá)水平降低;p21 mRNA與蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量依賴性的上調(diào)表達(dá)。結(jié)論1、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)評估:TDCIPP暴露能夠降低PC12細(xì)胞的生存率;破壞氧化、抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定性,使PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),ROS含量增多,SOD和GSH的含量降低,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多;促使PC12細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生,從而造成細(xì)胞的損傷。2、TDCIPP暴露對PC12細(xì)胞毒性作用機(jī)制的研究:利用DGE技術(shù)發(fā)現(xiàn),TDCIPP暴露致使PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)可能歸因于抑制了PI3K/Akt信號通路的激活,PI3K/Akt的磷酸化水平降低;Myc mRNA與蛋白水平降低,p21 mRNA與蛋白水平呈現(xiàn)劑量依賴性的上調(diào)表達(dá),從而引起PC12細(xì)胞凋亡率的增加,造成細(xì)胞的損傷。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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