本文關(guān)鍵詞： 原代支持細(xì)胞培養(yǎng) B(a)P 連接蛋白mRNA caspase-3抑制劑 抗氧化劑 PCB169　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：苯并(a)芘(B(a)P)是多環(huán)芳烴的代表物質(zhì),普遍存在于大氣、土壤與水中。它主要來自于煤焦油,汽車尾氣,各類有機(jī)物產(chǎn)生的煙霧,燒烤食物以及工業(yè)污水中。日常生活中接觸B(a)P主要通過污染空氣的吸入、吸煙以及飲食。 B(a)P具致癌性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和生殖毒性。以往關(guān)于B(a)P研究主要集中于致畸、致癌致突變等方面。近年來,生殖健康問題備受關(guān)注。B(a)P具有生殖毒性,它可以引起睪丸萎縮、精子數(shù)量及活動(dòng)能力下降,減低曲細(xì)精管的重量以及減少睪酮水平。但是B(a)P的雄性生殖毒性機(jī)制仍不完全清楚。 睪丸連接蛋白對(duì)于構(gòu)成血睪屏障以及精子發(fā)生所需的微環(huán)境所必需,睪丸細(xì)胞通過連接蛋白進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換,因此連接蛋白對(duì)睪丸細(xì)胞的增殖、成熟和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用。近年來,連接蛋白在外源化學(xué)物誘導(dǎo)的生殖毒性過程中的作用越來越受關(guān)注。然而在B(a)P的雄性生殖毒性機(jī)制中,B(a)P對(duì)連接蛋白的影響和機(jī)制尚不清楚。 本研究擬通過建立體外SD大鼠原代培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞的B(a)P染毒模型,探討B(tài)(a)P對(duì)睪丸支持細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)的變化,分析可能的毒性機(jī)制,為B(a)P雄性生殖風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、危害控制和預(yù)防提供依據(jù)。 研究方法：對(duì)21天大鼠睪丸通過兩步酶消化法分離得到睪丸支持細(xì)胞,通過形態(tài)、細(xì)胞活力和純度鑒定,顯示培養(yǎng)系細(xì)胞生長狀態(tài)良好,存活率大于94%,支持細(xì)胞純度大于95%。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用半定量PCR法測定了B(a)P(0,5,10和25μmol/L)6小時(shí)和12小時(shí)暴露對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的影響,應(yīng)用酶標(biāo)法測定了B(a)P染毒對(duì)caspase-3、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)的影響,并通過caspase-3抑制劑和抗氧化劑,分析了caspase-3及B(a)P誘導(dǎo)的氧化損傷對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的調(diào)控。 結(jié)果一B(a)P對(duì)支持細(xì)胞及連接蛋白mRNA表達(dá)的影響 形態(tài)學(xué)觀察顯示B(a)P暴露12小時(shí)后在25μmol/L可引起培養(yǎng)系細(xì)胞的形態(tài)變化,顯示支持細(xì)胞變瘦長,細(xì)胞間隙擴(kuò)大,精原細(xì)胞從支持細(xì)胞表面脫落聚集,出現(xiàn)細(xì)胞碎片。 染毒時(shí)間為6小時(shí),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力有下降趨勢,但與對(duì)照組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；染毒時(shí)間為12小時(shí),隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞活力呈下降趨勢,在濃度為25μmol/L時(shí),細(xì)胞活力下降明顯,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 本次研究主要檢測了緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1,錨定連接蛋白N-cadherin以及縫隙連接蛋白connexin-43口connexin-26。PCR結(jié)果顯示：在培養(yǎng)系暴露B(a)P6小時(shí)后,隨著劑量的增加,連接蛋白mRNA表達(dá)呈下降趨勢,在25μmol/L時(shí)connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)下降明顯,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而此劑量下ZO-1和N-cadherin mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)系暴露B(a)P12小時(shí)后,隨著劑量的增加,連接蛋白mRNA表達(dá)呈下降趨勢,在10μmol/L時(shí),connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)下降明顯,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在25μmol/L時(shí)ZO-1mRNA表達(dá)下降明顯,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);N-cadherinmRNA表達(dá)有下降趨勢,但與對(duì)照組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示了connexin-43、connexin-26、occludin mRNA表達(dá)可能更敏感于B(a)P的細(xì)胞活力。 結(jié)果二caspase-3可調(diào)節(jié)B(a)P誘導(dǎo)的支持細(xì)胞連接蛋白mRNA表達(dá)的變化 Caspase-3作為凋亡的中樞效應(yīng)器,被認(rèn)為是與凋亡最有關(guān)聯(lián)的酶,在細(xì)胞凋亡的起始和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。B(a)P暴露12小時(shí)后,隨著劑量的增加,caspase-3的活性呈上升趨勢,且在10μmol/L和25μmol/L劑量時(shí),與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在培養(yǎng)系中加入B(a)P并同時(shí)加入caspase-3制劑之后,caspase-3抑制劑拮抗了B(a)P (10μmol/L和25μmol/L)所誘導(dǎo)的caspase-3活性上升,與未染毒B(a)P的對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 加入B(a)P并同時(shí)加入caspase-3抑制劑之后,connexin-43、connexin-26、occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)在10μmol/L和25μmol/L時(shí)誘導(dǎo)的下降受到拮抗,與未染毒B(a)P的對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果三B(a)P誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響支持細(xì)胞連接蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)系暴露B(a)P12小時(shí)后,隨著劑量的增加,活性氧(ROS)水平也上升,MDA含量也上升,在B(a)P濃度為10μmol/L和25μmol/L時(shí),ROS和MDA含量明顯上升,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨B(a)P染毒劑量的增加,抗氧化酶活性下降：在B(a)P濃度為25μmol/L時(shí),SOD和GSHpx酶活性明顯下降,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在B(a)P濃度為10μmol/L和25μmol/L時(shí),CAT酶活性明顯下降,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 加入番茄紅素(lycopene)作為抗氧化劑后,番茄紅素拮抗了B(a)P所誘導(dǎo)的ROS和MDA水平上升,B(a)P+番茄紅素組和未加B(a)P對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)番茄紅素也拮抗了B(a)P染毒所誘導(dǎo)的抗氧化酶活性SOD、GSHpxCAT活性下降,B(a)P+番茄紅素組和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí),番茄紅素也拮抗了B(a)P所形成的連接蛋白connexin-43、connexin-26occludin和ZO-1的mRNA表達(dá),和未加B(a)P的對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示抗氧化劑可以預(yù)防B(a)P對(duì)支持細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果四聯(lián)合暴露PCB169增強(qiáng)B(a)P對(duì)支持細(xì)胞的毒性及對(duì)連接蛋白表達(dá)的毒作用 聯(lián)合暴露PCB169(5μmol/L)和B(a)P (5μmol/L、10μmol/L和25μmol/L)后,發(fā)現(xiàn)在B(a)P為25μmol/L時(shí),細(xì)胞活力、MDA、connexin43和occludin mRNA表達(dá)等指標(biāo)中,聯(lián)合暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性高于單獨(dú)暴露B(a)P組,與單獨(dú)暴露組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；PCB169增強(qiáng)B(a)P形成的毒性作用。在其余各指標(biāo)中,盡管PCB169有增強(qiáng)B(a)P毒效應(yīng)的趨勢,但聯(lián)合暴露組和單獨(dú)暴露組之間,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 在原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞中,B(a)P可引起支持細(xì)胞中連接蛋白基因mRNA表達(dá)的下降,支持細(xì)胞中連接蛋白可能是其毒作用的靶點(diǎn)。B(a)P可能通過其誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性以及氧化損傷降低連接蛋白基因的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉民;羅蘭;;睪丸支持細(xì)胞功能的研究進(jìn)展[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2012年01期

2 ;棉酚對(duì)大鼠生精上皮支持細(xì)胞影響的電鏡觀察[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1982年04期

3 周喜民;棉酚對(duì)大鼠支持細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響[J];生殖與避孕;1982年01期

4 胡志剛,張適,沙家豪;棉酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞緊密連接的影響[J];南京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1985年02期

5 李慧珍,何星華;不同旋光異構(gòu)體棉酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞的影響[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1993年02期

6 侯高銘;鄭俊鴻;周德榮;楊慶濤;;環(huán)磷酰胺及長春新堿對(duì)睪丸支持細(xì)胞間隙連接蛋白表達(dá)的影響[J];汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年01期

7 上官芳芳,史小林;睪丸支持細(xì)胞的功能及其應(yīng)用的探討[J];解剖學(xué)報(bào);2002年04期

8 謝紋,沈潔,王欣;唯支持細(xì)胞綜合征1例報(bào)告[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年11期

9 石建莉,徐晨;支持細(xì)胞與其周圍細(xì)胞之間的相互作用[J];生殖與避孕;2003年01期

10 胡承閱;配子細(xì)胞對(duì)支持細(xì)胞的黏附及細(xì)胞間相互作用[J];國外醫(yī)學(xué)(計(jì)劃生育分冊);2003年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳小玉;;睪丸支持細(xì)胞功能研究進(jìn)展[A];中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致癌專業(yè)委員會(huì)09年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

2 葉世雋;陳詠梅;;支持細(xì)胞中微絲對(duì)精子發(fā)生調(diào)控的研究[A];中國動(dòng)物學(xué)會(huì)全國顯微與亞顯微形態(tài)科學(xué)（細(xì)胞及分子顯微技術(shù)科學(xué)）分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2002年

3 采克俊;張易祥;丁海雷;丁志麗;張念慈;劉莉;;18天雞胚睪丸支持細(xì)胞的分離純化與鑒定[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨青年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2007年

4 鄭明華;林海龍;陳永平;;睪丸支持細(xì)胞與移植[A];2008年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

5 吳應(yīng)積;羅奮華;旭日干;;絨山羊睪丸支持細(xì)胞與生殖細(xì)胞的長期培養(yǎng)和觀察[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

6 周莉;吳純啟;馬華智;廖明陽;;羥基脲對(duì)大鼠Sertoli-germ細(xì)胞共培養(yǎng)的影響[A];2006年全國藥物毒理學(xué)會(huì)議論文集[C];2006年

7 周銀濤;王鮮忠;周玉蘭;趙伯川;陳永軍;張家驊;;仔豬睪丸組織在出生后早期細(xì)胞增殖能力變化[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)分會(huì)第五屆全體會(huì)議第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

8 孔慶學(xué);江紅;段翠密;李洪波;吳靖芳;韓曉明;王常勇;;微重力條件下胰島與睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[A];提高全民科學(xué)素質(zhì)、建設(shè)創(chuàng)新型國家——2006中國科協(xié)年會(huì)論文集（下冊）[C];2006年

9 鄭明華;林海龍;陳永平;;睪丸支持細(xì)胞與移植[A];第十次浙江省中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 米美玲;鄒挺;楊蓓;熊明娣;王晶磊;徐斯凡;;睪丸支持細(xì)胞與大鼠海馬細(xì)胞培養(yǎng)作用的初步研究[A];Proceedings of the 7th Biennial Meeting and the 5th Congress of the Chinese Society for Neuroscience[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 李天舒;干細(xì)胞功能下降可致人類衰老[N];健康報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張勇;缺氧對(duì)于大鼠原代支持細(xì)胞的損傷作用和機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

2 江小華;支持細(xì)胞依賴的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育影響的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2014年

3 周德榮;棉酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞間隙連接蛋白43表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的研究[D];汕頭大學(xué);2009年

4 邱志群;鄰苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的聯(lián)合毒性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

5 汪秀星;兒童時(shí)期腮腺炎病毒感染導(dǎo)致成年男性不育與支持細(xì)胞的蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾的改變相關(guān)[D];南京大學(xué);2013年

6 宋楊;P，，p'-DDE誘導(dǎo)ROS在線粒體和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用[D];華中科技大學(xué);2009年

7 張順;MTA2在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 張明;鎘誘導(dǎo)仔豬睪丸支持細(xì)胞凋亡及機(jī)理研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 李潔;雄性小鼠睪丸支持細(xì)胞中Attractin的功能研究[D];華中科技大學(xué);2009年

10 季佳佳;CS_2致男（雄）性下丘腦—垂體—性腺軸功能紊亂機(jī)制初探及NO的干預(yù)作用[D];華中科技大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 武海軍;犢牛睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其對(duì)淋巴細(xì)胞的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

2 王冰冰;五味子中殘留農(nóng)藥對(duì)睪丸支持細(xì)胞的毒性研究[D];哈爾濱商業(yè)大學(xué);2013年

3 田歡;睪丸支持細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移影響的基礎(chǔ)研究[D];華東理工大學(xué);2014年

4 王勇梅;鄰苯二甲酸二丁酯損傷大鼠睪丸支持細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];河北聯(lián)合大學(xué);2011年

5 石之虎;鎘對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的損傷及黃芪的拮抗作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

6 張波;超聲靶向微泡破壞對(duì)支持細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

7 李周;鈷60-γ射線致小鼠睪丸支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損害[D];鄭州大學(xué);2013年

8 趙吉存;不同溫度下大鼠睪丸支持細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子的表達(dá)[D];青島大學(xué);2014年

9 李翠珍;苯并（a）芘對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞連接蛋白基因表達(dá)的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

10 孫紅艷;小鼠支持細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：1526234