本文關(guān)鍵詞： 醋酸鎘 PC12細胞 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元 自噬 LC3 衰老 β-半乳糖苷酶 P21 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 Bip AMPK ROS　出處：《揚州大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：自噬是細胞本身通過溶酶體降解途徑來清除細胞質(zhì)中蛋白大分子和細胞器的一種在進化上高度保守的現(xiàn)象。細胞在代謝應(yīng)激條件下,細胞能夠通過自噬清除異常代謝物質(zhì),避免細胞病變、損傷以及變性的發(fā)生,因此,自噬在促進細胞存活中發(fā)揮重要作用。鎘是一種具有高毒性的工業(yè)和環(huán)境污染物,能夠?qū)θ撕蛣游锏慕】翟斐蓳p傷。近年來研究表明,鎘能夠通過血腦屏障進入腦組織,影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。臨床研究發(fā)現(xiàn),鎘能夠造成神經(jīng)行為缺陷,是導致兒童認知障礙和神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要原因。體外研究表明,神經(jīng)細胞自噬在鎘引起的毒性損傷中具有保護作用。最新研究表明,神經(jīng)元衰老是導致神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一。但是鎘對神經(jīng)細胞衰老影響以及自噬在神經(jīng)細胞衰老中的作用尚不明確。本研究擬采用PC12細胞和大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元(原代神經(jīng)細胞)作為模型,通過體外實驗探討鎘誘導神經(jīng)細胞自噬發(fā)生的機制,研究自噬在鎘致神經(jīng)細胞衰老中的作用及調(diào)控機制,為揭示鎘致神經(jīng)細胞毒性機理提供科學依據(jù)。1.鎘對神經(jīng)細胞衰老的影響為了研究鎘對神經(jīng)細胞衰老的影響,本實驗選用PC12細胞作為模型。用RTCA實時檢測技術(shù)監(jiān)測不同濃度醋酸鎘(0、2.5、5、10 μmol/L)處理條件下PC12細胞的生長曲線,結(jié)果表明,與對照組細胞相比,10 μmol/LCd組細胞的細胞指數(shù)(CI)明顯下降。在一定的濃度和時間范圍內(nèi),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴和時間依賴效應(yīng),說明鎘對PC12細胞具有明顯的毒性作用;選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞作為模型,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μmol/L)分別處理PC12細胞和原代神經(jīng)細胞24h后,統(tǒng)計PC12細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量;qRT-PCR法檢測鎘對原代神經(jīng)細胞炎性因子ILlα、IL6基因表達的影響;蛋白免疫印跡法檢測PC12細胞衰老相關(guān)蛋白P53、P21、P16的表達;10 μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞不同時間(0、2、4、6、8、12、24 h),蛋白免疫印跡法檢測PC12細胞衰老相關(guān)蛋白的表達;10 μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞24 h,通過對F-actin染色,觀察鎘對PC12細胞及原代神經(jīng)細胞骨架的影響;結(jié)果表明,與對照組相比,10μmol/L醋酸鎘處理PC12細胞24 h能夠極顯著增加表達β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量(P0.01);PC12細胞或原代神經(jīng)細胞內(nèi)F-actin結(jié)構(gòu)受到明顯的損傷;PC12細胞P53、P21和P16衰老相關(guān)蛋白的表達顯著性升高(P0.01)呈時間和劑量依賴關(guān)系;隨著鎘濃度的升高,原代神經(jīng)細胞炎性因子IL1α、IL6基因的表達量逐漸升高呈劑量依賴關(guān)系(P0.01)。提示鎘能促進神經(jīng)細胞衰老。2.自噬在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用為了探討自噬在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用,本研究采用自噬激活劑100 nmol/L雷帕霉素(RAP)預處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞24 h,用醋酸鎘處理24 h,統(tǒng)計β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量,結(jié)果顯示,與單獨染鎘組相比,RAP與鎘聯(lián)合處理組PC12細胞中β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量極顯著減少(P0.01)。免疫印跡法檢測PC12細胞中P53、P21和P16相關(guān)蛋白的表達,與鎘單獨處理組相比,RAP與鎘共處理組P53、P21和P16衰老相關(guān)蛋白的表達水平極顯著性降低(P0.01);RT-PCR法檢測原代神經(jīng)細胞IL1α、IL6基因的表達,結(jié)果顯示,RAP能夠抑制鎘引起的IL1α、IL6基因的表達(P0.01)。通過采用自噬的抑制劑CQ或3-MA預處理PC12細胞0.5 h,或采用Atg5 siRNA干擾技術(shù)抑制自噬,然后鎘處理細胞6h,通過采用RTCA技術(shù)測定細胞細胞生長曲線,與鎘單獨處理6 h組相比,添加CQ后能夠明顯降低PC12細胞指數(shù);免疫印跡結(jié)果顯示,與鎘單獨處理組相比,添加3-MA或轉(zhuǎn)染Atg5 siRNA均能夠促進衰老相關(guān)蛋白表達的增加。綜上說明自噬在鎘誘導的神經(jīng)細胞衰老中具有抑制作用。3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中的作用為探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中的作用,本研究選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞作為模型,10μmol/L醋酸鎘分別處理PC12細胞和原代神經(jīng)細胞不同時間(0、2、4、6、8、12、24 h),免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、ATF4、CHOP、p-eIF2α的表達。結(jié)果顯示,10 μmol/L醋酸鎘處理兩種細胞不同時間后,PC12細胞中CHOP蛋白隨著時間的延長,表達量逐漸升高,其余蛋白的表達在6 h達到最高,然后逐漸降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑mithramycin與醋酸鎘單獨或聯(lián)合培養(yǎng)PC12細胞和原代神經(jīng)細胞6 h,免疫印跡法檢測Bip、LC3蛋白表達;通過間接免疫熒光染色,觀察Bip蛋白的表達及分布;將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有EGFP-RFP-LC3B基因的PC12細胞按照上述方法處理后,激光共聚焦觀察LC3聚點。結(jié)果表明,Mithramycin不但顯著抑制了鎘誘導的Bip蛋白的表達,同時還能明顯降低LC3-Ⅱ的表達水平(P0.01)及LC3聚點。說明鎘能夠誘導神經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬中起到正調(diào)控作用。4.Bip/AMPK在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與衰老中的作用為進一步說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶Bip在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與衰老中的作用,用Bip siRNA轉(zhuǎn)染PC12細胞抑制Bip基因表達,10μmol/L醋酸鎘分別處理陰性干擾(NC)組和Bip干擾(siBip)組細胞不同時間(0、2、6、24h),試劑盒法檢測并統(tǒng)計β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量;免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白Bip、LC3、P21的表達。結(jié)果顯示,與NC組相比,鎘處理siBip組6 h后β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量極顯著增加(P0.01);Bip、P-AMPK和LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯下降,P21蛋白表達量明顯升高。鎘處理NC組Bip干擾siBip組細胞6 h或鎘與Bip抑制劑BAPTA單獨或聯(lián)合作用細胞6 h,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)EGFP-RFP-LC3的表達及分布。結(jié)果顯示,與NC組細胞相比,鎘處理siBip細胞6h后,LC3黃色聚點明顯減少;與鎘單獨處理組相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細胞LC3黃色聚點明顯減少。為了探究Bip在鎘激活AMPK/mTOR通路中的作用,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μmol/L)處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6h,結(jié)果表明,隨著鎘濃度的升高,P-AMPK表達量逐漸升高,呈劑量依賴關(guān)系;鎘與BAPTA單獨或聯(lián)合作用PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6 h,免疫印跡檢測P-AMPK表達,結(jié)果顯示,與鎘單獨處理組細胞相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細胞AMPK磷酸化水平極顯著性降低(P0.01)。鎘處理NC細胞和siBip細胞6h,免疫印跡檢測P-AMPK、P-AKT、P-S6K蛋白表達,與NC組細胞相比,鎘處理siBip組細胞P-AMPK蛋白表達水平降低,P-AKT、P-S6K蛋白表達水平升高。綜上說明Bip在鎘誘導的神經(jīng)細胞自噬與衰老以及在鎘激活AMPK通路中具有調(diào)節(jié)作用。5.ROS在鎘誘導原代神經(jīng)細胞自噬和衰老中的作用為了揭示ROS在神經(jīng)細胞自噬和衰老中的作用,本研究選用PC12細胞和原代神經(jīng)細胞為模型,10 μmol/L鎘和ROS抑制劑100 nmol/LNAC單獨或聯(lián)合處理PC12細胞或原代神經(jīng)細胞6h或24h,結(jié)果顯示,與鎘單獨處理組相比,NAC與鎘聯(lián)合處理6h,PC12細胞中LC3Ⅱ蛋白的表達無明顯變化;20 μmol/L鎘和100 nmol/LNAC單獨或聯(lián)合處理原代神經(jīng)細胞6h免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Atg7表達(P0.01)。為說明ROS在鎘誘導神經(jīng)細胞衰老中的作用,NAC與鎘聯(lián)合處理細胞24 h,與鎘單獨處理組相比,PC12細胞P21蛋白表達量降低,呈極顯著性差異(P0.01),β-半乳糖苷酶陽性細胞的數(shù)量極顯著性減少(P0.01),原代神經(jīng)細胞IL1α、IL6基因表達水平極顯著性降低(P0.01)。綜上說明,不同濃度的鎘在不同時間對神經(jīng)細胞自噬和衰老的影響不同,ROS在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與衰老的過程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

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本文編號：1503937