本文關(guān)鍵詞： 醋酸鎘 PC12細(xì)胞 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元 自噬 LC3 衰老 β-半乳糖苷酶 P21 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 Bip AMPK ROS　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自噬是細(xì)胞本身通過(guò)溶酶體降解途徑來(lái)清除細(xì)胞質(zhì)中蛋白大分子和細(xì)胞器的一種在進(jìn)化上高度保守的現(xiàn)象。細(xì)胞在代謝應(yīng)激條件下,細(xì)胞能夠通過(guò)自噬清除異常代謝物質(zhì),避免細(xì)胞病變、損傷以及變性的發(fā)生,因此,自噬在促進(jìn)細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。鎘是一種具有高毒性的工業(yè)和環(huán)境污染物,能夠?qū)θ撕蛣?dòng)物的健康造成損傷。近年來(lái)研究表明,鎘能夠通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織,影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。臨床研究發(fā)現(xiàn),鎘能夠造成神經(jīng)行為缺陷,是導(dǎo)致兒童認(rèn)知障礙和神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要原因。體外研究表明,神經(jīng)細(xì)胞自噬在鎘引起的毒性損傷中具有保護(hù)作用。最新研究表明,神經(jīng)元衰老是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一。但是鎘對(duì)神經(jīng)細(xì)胞衰老影響以及自噬在神經(jīng)細(xì)胞衰老中的作用尚不明確。本研究擬采用PC12細(xì)胞和大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元(原代神經(jīng)細(xì)胞)作為模型,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬發(fā)生的機(jī)制,研究自噬在鎘致神經(jīng)細(xì)胞衰老中的作用及調(diào)控機(jī)制,為揭示鎘致神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。1.鎘對(duì)神經(jīng)細(xì)胞衰老的影響為了研究鎘對(duì)神經(jīng)細(xì)胞衰老的影響,本實(shí)驗(yàn)選用PC12細(xì)胞作為模型。用RTCA實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)不同濃度醋酸鎘(0、2.5、5、10 μmol/L)處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明,與對(duì)照組細(xì)胞相比,10 μmol/LCd組細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)(CI)明顯下降。在一定的濃度和時(shí)間范圍內(nèi),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴和時(shí)間依賴效應(yīng),說(shuō)明鎘對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯的毒性作用;選用PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞作為模型,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μmol/L)分別處理PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞24h后,統(tǒng)計(jì)PC12細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量;qRT-PCR法檢測(cè)鎘對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞炎性因子ILlα、IL6基因表達(dá)的影響;蛋白免疫印跡法檢測(cè)PC12細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P53、P21、P16的表達(dá);10 μmol/L醋酸鎘處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間(0、2、4、6、8、12、24 h),蛋白免疫印跡法檢測(cè)PC12細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白的表達(dá);10 μmol/L醋酸鎘處理PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞24 h,通過(guò)對(duì)F-actin染色,觀察鎘對(duì)PC12細(xì)胞及原代神經(jīng)細(xì)胞骨架的影響;結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,10μmol/L醋酸鎘處理PC12細(xì)胞24 h能夠極顯著增加表達(dá)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量(P0.01);PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)F-actin結(jié)構(gòu)受到明顯的損傷;PC12細(xì)胞P53、P21和P16衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著性升高(P0.01)呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系;隨著鎘濃度的升高,原代神經(jīng)細(xì)胞炎性因子IL1α、IL6基因的表達(dá)量逐漸升高呈劑量依賴關(guān)系(P0.01)。提示鎘能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞衰老。2.自噬在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞衰老中的作用為了探討自噬在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞衰老中的作用,本研究采用自噬激活劑100 nmol/L雷帕霉素(RAP)預(yù)處理PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞24 h,用醋酸鎘處理24 h,統(tǒng)計(jì)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量,結(jié)果顯示,與單獨(dú)染鎘組相比,RAP與鎘聯(lián)合處理組PC12細(xì)胞中β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量極顯著減少(P0.01)。免疫印跡法檢測(cè)PC12細(xì)胞中P53、P21和P16相關(guān)蛋白的表達(dá),與鎘單獨(dú)處理組相比,RAP與鎘共處理組P53、P21和P16衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)水平極顯著性降低(P0.01);RT-PCR法檢測(cè)原代神經(jīng)細(xì)胞IL1α、IL6基因的表達(dá),結(jié)果顯示,RAP能夠抑制鎘引起的IL1α、IL6基因的表達(dá)(P0.01)。通過(guò)采用自噬的抑制劑CQ或3-MA預(yù)處理PC12細(xì)胞0.5 h,或采用Atg5 siRNA干擾技術(shù)抑制自噬,然后鎘處理細(xì)胞6h,通過(guò)采用RTCA技術(shù)測(cè)定細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,與鎘單獨(dú)處理6 h組相比,添加CQ后能夠明顯降低PC12細(xì)胞指數(shù);免疫印跡結(jié)果顯示,與鎘單獨(dú)處理組相比,添加3-MA或轉(zhuǎn)染Atg5 siRNA均能夠促進(jìn)衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的增加。綜上說(shuō)明自噬在鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞衰老中具有抑制作用。3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用為探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用,本研究選用PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞作為模型,10μmol/L醋酸鎘分別處理PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞不同時(shí)間(0、2、4、6、8、12、24 h),免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、ATF4、CHOP、p-eIF2α的表達(dá)。結(jié)果顯示,10 μmol/L醋酸鎘處理兩種細(xì)胞不同時(shí)間后,PC12細(xì)胞中CHOP蛋白隨著時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量逐漸升高,其余蛋白的表達(dá)在6 h達(dá)到最高,然后逐漸降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑mithramycin與醋酸鎘單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng)PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞6 h,免疫印跡法檢測(cè)Bip、LC3蛋白表達(dá);通過(guò)間接免疫熒光染色,觀察Bip蛋白的表達(dá)及分布;將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有EGFP-RFP-LC3B基因的PC12細(xì)胞按照上述方法處理后,激光共聚焦觀察LC3聚點(diǎn)。結(jié)果表明,Mithramycin不但顯著抑制了鎘誘導(dǎo)的Bip蛋白的表達(dá),同時(shí)還能明顯降低LC3-Ⅱ的表達(dá)水平(P0.01)及LC3聚點(diǎn)。說(shuō)明鎘能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬中起到正調(diào)控作用。4.Bip/AMPK在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬與衰老中的作用為進(jìn)一步說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶Bip在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬與衰老中的作用,用Bip siRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞抑制Bip基因表達(dá),10μmol/L醋酸鎘分別處理陰性干擾(NC)組和Bip干擾(siBip)組細(xì)胞不同時(shí)間(0、2、6、24h),試劑盒法檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量;免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白Bip、LC3、P21的表達(dá)。結(jié)果顯示,與NC組相比,鎘處理siBip組6 h后β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量極顯著增加(P0.01);Bip、P-AMPK和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯下降,P21蛋白表達(dá)量明顯升高。鎘處理NC組Bip干擾siBip組細(xì)胞6 h或鎘與Bip抑制劑BAPTA單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞6 h,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)EGFP-RFP-LC3的表達(dá)及分布。結(jié)果顯示,與NC組細(xì)胞相比,鎘處理siBip細(xì)胞6h后,LC3黃色聚點(diǎn)明顯減少;與鎘單獨(dú)處理組相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細(xì)胞LC3黃色聚點(diǎn)明顯減少。為了探究Bip在鎘激活A(yù)MPK/mTOR通路中的作用,不同濃度醋酸鎘(0、5、10、20μmol/L)處理PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞6h,結(jié)果表明,隨著鎘濃度的升高,P-AMPK表達(dá)量逐漸升高,呈劑量依賴關(guān)系;鎘與BAPTA單獨(dú)或聯(lián)合作用PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞6 h,免疫印跡檢測(cè)P-AMPK表達(dá),結(jié)果顯示,與鎘單獨(dú)處理組細(xì)胞相比,BAPTA與鎘聯(lián)合處理組細(xì)胞AMPK磷酸化水平極顯著性降低(P0.01)。鎘處理NC細(xì)胞和siBip細(xì)胞6h,免疫印跡檢測(cè)P-AMPK、P-AKT、P-S6K蛋白表達(dá),與NC組細(xì)胞相比,鎘處理siBip組細(xì)胞P-AMPK蛋白表達(dá)水平降低,P-AKT、P-S6K蛋白表達(dá)水平升高。綜上說(shuō)明Bip在鎘誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬與衰老以及在鎘激活A(yù)MPK通路中具有調(diào)節(jié)作用。5.ROS在鎘誘導(dǎo)原代神經(jīng)細(xì)胞自噬和衰老中的作用為了揭示ROS在神經(jīng)細(xì)胞自噬和衰老中的作用,本研究選用PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞為模型,10 μmol/L鎘和ROS抑制劑100 nmol/LNAC單獨(dú)或聯(lián)合處理PC12細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞6h或24h,結(jié)果顯示,與鎘單獨(dú)處理組相比,NAC與鎘聯(lián)合處理6h,PC12細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化;20 μmol/L鎘和100 nmol/LNAC單獨(dú)或聯(lián)合處理原代神經(jīng)細(xì)胞6h免疫印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Atg7表達(dá)(P0.01)。為說(shuō)明ROS在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞衰老中的作用,NAC與鎘聯(lián)合處理細(xì)胞24 h,與鎘單獨(dú)處理組相比,PC12細(xì)胞P21蛋白表達(dá)量降低,呈極顯著性差異(P0.01),β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量極顯著性減少(P0.01),原代神經(jīng)細(xì)胞IL1α、IL6基因表達(dá)水平極顯著性降低(P0.01)。綜上說(shuō)明,不同濃度的鎘在不同時(shí)間對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬和衰老的影響不同,ROS在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬與衰老的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：1503937