發(fā)布時間：2018-02-11 13:12

  本文關(guān)鍵詞： HgCl_2 蘆丁 氧化應激 凋亡 Nrf-2 ERK Akt　出處：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：【背景】經(jīng)濟的不斷發(fā)展,給人們帶來方便的同時,也導致環(huán)境污染問題日益嚴重,環(huán)境污染正在危害全人類的健康,其造成的健康影響已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一。環(huán)境污染物種類很多,重金屬就是其中一大類,如汞、鉛、鎘等。目前認為氧化應激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡等與重金屬引起機體多個臟器損傷的發(fā)病機制密切相關(guān)。很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)汞及其化合物可通過氧化應激、炎癥等對機體腎、肝和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。目前對汞誘導的肝損傷并無特效的預防治療方法。很多研究報道,一些具有抗氧化作用的物質(zhì),如維生素E、硒、NAC、槲皮素等,可通過抑制氧化應激對氯化汞(HgCl_2)誘導的肝損傷發(fā)揮一定保護作用,提示氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)失調(diào)導致氧化應激可能是汞中毒損傷的主要機制。蘆丁,作為一種重要的、人們生活中接觸較多的類黃酮類物質(zhì),具有多種生理、藥理功能,如抗驚厥、抗抑郁、抗菌、抗炎、抗氧化等作用。大量文獻和研究提示,蘆丁對STZ誘導的糖尿病具有治療作用;對多種毒物誘導的胃腸道損傷也具有輔助治療和預防的作用;對CCl4、乙醇誘導的肝損傷具有保護作用。蘆丁可以通過抑制脂質(zhì)聚集,增強AMPK的活性,增強PPARα的表達和抗氧化酶的活性發(fā)揮保肝作用。蘆丁可以通過增強PC12細胞中的PI3k/AKT/mTOR和ERK1/2的磷酸化水平發(fā)揮對SNP誘導損傷的保護作用;蘆丁可以通過激活MAPK信號通路及BDNF基因表達發(fā)揮對β淀粉酶誘導神經(jīng)損傷的保護作用。那么,蘆丁對HgCl_2誘導的肝腎損傷有沒有保護作用呢?MAPKs和PI3k/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡過程非常重要的分子通路,在蘆丁對HgCl_2誘導肝腎損傷的保護作用中發(fā)揮什么樣的功能呢?本研究明確了HgCl_2可誘導機體肝腎損傷,并結(jié)合蘆丁本身具有的抗氧化、抗炎作用、保肝作用,探索蘆丁對HgCl_2誘導肝腎損傷的預防作用及其相關(guān)機制,明確PI3k/Akt,MAPKs信號通路在蘆丁發(fā)揮保護作用過程中的功能。綜上所述,面對目前嚴重的環(huán)境污染及人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|低劑量汞的現(xiàn)實狀況,蘆丁作為一種人們生活中接觸頻繁的抗氧化物質(zhì),會對HgCl_2導致的肝腎損傷起到一定的預防和保護作用�！灸康摹�1、探討HgCl_2誘導的肝、腎損傷特點,明確HgCl_2誘導肝腎損傷的機制;2、探討汞誘導肝、腎損傷以及蘆丁發(fā)揮保護作用過程中ERK和Akt信號分子的作用;3、探索HgCl_2誘導肝細胞損傷的劑量效應以及蘆丁的劑量依賴性保護作用;4、明確蘆丁發(fā)揮保護作用過程中,ERK、Akt磷酸化與凋亡、氧化應激的關(guān)系�！痉椒ā�1、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導肝損傷保護作用的體內(nèi)實驗:實驗大鼠為為正常組、Rutin組、HgCl_2染毒組、HgCl_~(2+)Rutin組,實驗開始前適應性喂養(yǎng)3天。第4天起(1)正常組:早8時腹腔注射生理鹽水約2ml,第5-7天每天早8時灌胃給予含5%DMSO的生理鹽水。(2)Rutin組:早8時腹腔注射生理鹽水約2ml,第5-7天每天早8時,灌胃給予蘆丁溶液(150mg/kg)。(3)HgCl_2組:早8時腹腔注射HgCl_2鹽溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8時灌胃給予含5%DMSO生理鹽水。(4)HgCl_~(2+)Rutin組:早8時腹腔注射HgCl_2鹽溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8時灌胃給予蘆丁溶液(150mg/kg)。實驗持續(xù)周期為4天。最后一次給予蘆丁后,禁食約8小時后稱量體重,腹腔注射苯巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉后,打開腹腔抽取腹主動脈血,并去除肝臟、腎臟稱重并記錄。大生化儀檢測血清ALT、AST、ALB等評價肝功能的指標。采用DHE探針檢測肝冰凍切片ROS的水平,利用試劑盒檢測肝組織GSSG含量和MDA水平評價氧化應激損傷。試劑盒檢測肝CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達水平,評價蘆丁對HgCl_2導致肝抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達水平,評價蘆丁對HgCl_2誘導凋亡相關(guān)分子蛋白表達變化的影響。最后通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平的變化。2、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導腎損傷影響的體內(nèi)實驗:動物分組及處理同前。最后一次給藥結(jié)束后,禁食8小時,稱量動物體重,處死動物并稱其腎重。血清UREA、CRE等腎功能的指標采用大生化儀檢測。腎冰凍切片ROS的水平,采用DHE探針檢測。利用試劑盒檢測氧化應激損傷的指標,GSSG含量和MDA水平。試劑盒檢測CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達水平,評價蘆丁對HgCl_2導致腎抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達水平,評價蘆丁對HgCl_2誘導腎細胞凋亡相關(guān)分子蛋白表達變化的影響。最后通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平的變化。3、Hg~(2+)(HgCl_2)誘導肝損傷體外實驗:L02細胞暴露于1-150μM的HgCl_2處理3、4、5、6、7、8小時,誘導肝細胞損傷。MTT檢測細胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細胞凋亡。采用DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)ROS水平。4、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導肝細胞損傷保護作用的體外實驗:實驗分組:Con,Ru,HgCl_2,20μMRu+HgCl_2,40μMRu+HgCl_2,60μMRu+HgCl_2。L02細胞先給于不同濃度蘆丁20μM、40μM、60μM,預處理12小時,再暴露于60μM的HgCl_2,處理6小時,觀察蘆丁的保護作用。MTT檢測細胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細胞凋亡。DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)ROS水平。JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位(MMP)。用活體細胞線粒體膜孔通道熒光檢測試劑盒檢測細胞線粒體膜孔通道活性(MPTP)。試劑盒檢測GSSG含量和MDA水平,評價細胞氧化應激損傷。試劑盒檢測CAT和T-SOD活力、GSH含量以及GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達,評價蘆丁對HgCl_2誘導肝細胞抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達,評價蘆丁對HgCl_2誘導肝細胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子表達水平變化的影響。通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平。使用PI3K和Erk的抑制劑LY294002和U0126后,MTT檢測細胞活力,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達及凋亡家族蛋白表達水平,明確蘆丁是通過激活Akt和Erk的磷酸化,增強抗氧化防御系統(tǒng)功能,抑制凋亡發(fā)生,發(fā)揮對HgCl_2導致肝細胞損傷的保護作用�！窘Y(jié)果】1、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導大鼠肝損傷有一定的保護作用。蘆丁改善了HgCl_2導致的大鼠體重增加的減少、肝體比增加;改善了HgCl_2誘導的肝功能、氧化應激損傷;提高了相關(guān)抗氧化蛋白的表達以及抗氧化酶的含量與活力;改善了肝內(nèi)細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的改變;蘆丁在一定程度上改善了HgCl_2導致的大鼠肝組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。2、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導大鼠腎損傷有一定的保護作用。蘆丁改善了HgCl_2導致的大鼠體重增加的減少、腎體比增加;改善了HgCl_2誘導的腎功能的改變、氧化應激損傷;提高了抗氧化蛋白的表達及抗氧化酶的含量與活力;改善了腎內(nèi)細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的改變;蘆丁在一定程度上改善了HgCl_2導致的大鼠腎組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。3、Hg~(2+)(HgCl_2)處理L02細胞,在一定濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性降低細胞活力下降,劑量依賴性導致細胞凋亡增加、活性氧水平升高,并建立良好的肝細胞損傷模型。4、蘆丁預處理能夠減輕Hg~(2+)(HgCl_2)誘導的肝細胞氧化應激水平。蘆丁預處理能夠改善HgCl_2導致的細胞活力降低,與HgCl_2損傷組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);還可抑制HgCl_2導致的細胞內(nèi)ROS的增加(P0.05);緩解CAT、GSH、T-SOD等的活性/含量的降低(P0.05);SOD2、CAT、Nrf2的蛋白表達水平升高,增強抗氧化防御系統(tǒng)功能。5、蘆丁預處理能夠抑制Hg~(2+)(HgCl_2)誘導的肝細胞凋亡。蘆丁預處理顯著抑制HgCl_2誘導的肝細胞凋亡,與HgCl_2組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);蘆丁預處理導致Bcl2的表達水平上升,Bax表達水平下降,Bax/Bcl2比值降低,與HgCl_2組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),Caspase3表達水平也有所下降。6、蘆丁預處理能夠改善Hg~(2+)(HgCl_2)誘導的細胞線粒體功能障礙。蘆丁預處理改善了HgCl_2誘導的細胞線粒體膜電位的下降和線粒體膜孔通道活性的降低。7、蘆丁預處理改善了Hg~(2+)(HgCl_2)誘導的細胞內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。蘆丁預處理后,肝細胞內(nèi)ERK磷酸化水平與HgCl_2相比顯著升高(P0.05),Akt磷酸化水平與HgCl_2組相比亦有所改善,但不顯著。8、ERK抑制劑(U0126)和PI3K抑制劑(LY294002)可在一定程度上消除蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導的肝細胞活力下降的改善作用。U0126、LY294002前處理細胞組,抗凋亡蛋白Bcl2表達降低,與蘆丁預處理組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與HgCl_2組Bcl2的表達相當;BAX/Bcl2比值,與蘆丁處理組相比顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。用ERK和PI3K抑制劑前處理細胞組,SOD1、SOD2及CAT的蛋白表達水平與蘆丁預處理相比有所降低,與HgCl_2組三類蛋白的表達水平基本一致。即蘆丁可通過激活ERK、Akt信號分子磷酸化,增強抗氧化防御系統(tǒng)功能,抑制細胞凋亡,發(fā)揮對HgCl_2誘導的肝細胞損傷的保護作用�！窘Y(jié)論】1、HgCl_2可破壞機體抗氧化防御系統(tǒng),導致氧化應激、線粒體損傷,凋亡發(fā)生。2、HgCl_2可在一定程度上抑制ERK和Akt磷酸化,參與組織及細胞損傷。3、蘆丁可增強抗氧化防御系統(tǒng)功能、減少ROS產(chǎn)生,提高抗氧化酶活性,減緩組織損傷及細胞凋亡。4、蘆丁可能通過激活ERK和Akt磷酸化,增強抗氧化防御系統(tǒng)功能,緩解器官損傷及凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114
，

本文編號：1503142