本文關(guān)鍵詞： HgCl_2 蘆丁 氧化應(yīng)激 凋亡 Nrf-2 ERK Akt　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【背景】經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,給人們帶來方便的同時(shí),也導(dǎo)致環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重,環(huán)境污染正在危害全人類的健康,其造成的健康影響已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題之一。環(huán)境污染物種類很多,重金屬就是其中一大類,如汞、鉛、鎘等。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙、凋亡等與重金屬引起機(jī)體多個(gè)臟器損傷的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)汞及其化合物可通過氧化應(yīng)激、炎癥等對機(jī)體腎、肝和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。目前對汞誘導(dǎo)的肝損傷并無特效的預(yù)防治療方法。很多研究報(bào)道,一些具有抗氧化作用的物質(zhì),如維生素E、硒、NAC、槲皮素等,可通過抑制氧化應(yīng)激對氯化汞(HgCl_2)誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用,提示氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激可能是汞中毒損傷的主要機(jī)制。蘆丁,作為一種重要的、人們生活中接觸較多的類黃酮類物質(zhì),具有多種生理、藥理功能,如抗驚厥、抗抑郁、抗菌、抗炎、抗氧化等作用。大量文獻(xiàn)和研究提示,蘆丁對STZ誘導(dǎo)的糖尿病具有治療作用;對多種毒物誘導(dǎo)的胃腸道損傷也具有輔助治療和預(yù)防的作用;對CCl4、乙醇誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。蘆丁可以通過抑制脂質(zhì)聚集,增強(qiáng)AMPK的活性,增強(qiáng)PPARα的表達(dá)和抗氧化酶的活性發(fā)揮保肝作用。蘆丁可以通過增強(qiáng)PC12細(xì)胞中的PI3k/AKT/mTOR和ERK1/2的磷酸化水平發(fā)揮對SNP誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用;蘆丁可以通過激活MAPK信號通路及BDNF基因表達(dá)發(fā)揮對β淀粉酶誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。那么,蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)的肝腎損傷有沒有保護(hù)作用呢?MAPKs和PI3k/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡過程非常重要的分子通路,在蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)肝腎損傷的保護(hù)作用中發(fā)揮什么樣的功能呢?本研究明確了HgCl_2可誘導(dǎo)機(jī)體肝腎損傷,并結(jié)合蘆丁本身具有的抗氧化、抗炎作用、保肝作用,探索蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)肝腎損傷的預(yù)防作用及其相關(guān)機(jī)制,明確PI3k/Akt,MAPKs信號通路在蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中的功能。綜上所述,面對目前嚴(yán)重的環(huán)境污染及人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|低劑量汞的現(xiàn)實(shí)狀況,蘆丁作為一種人們生活中接觸頻繁的抗氧化物質(zhì),會(huì)對HgCl_2導(dǎo)致的肝腎損傷起到一定的預(yù)防和保護(hù)作用。【目的】1、探討HgCl_2誘導(dǎo)的肝、腎損傷特點(diǎn),明確HgCl_2誘導(dǎo)肝腎損傷的機(jī)制;2、探討汞誘導(dǎo)肝、腎損傷以及蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中ERK和Akt信號分子的作用;3、探索HgCl_2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的劑量效應(yīng)以及蘆丁的劑量依賴性保護(hù)作用;4、明確蘆丁發(fā)揮保護(hù)作用過程中,ERK、Akt磷酸化與凋亡、氧化應(yīng)激的關(guān)系�！痉椒ā�1、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)肝損傷保護(hù)作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)大鼠為為正常組、Rutin組、HgCl_2染毒組、HgCl_~(2+)Rutin組,實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。第4天起(1)正常組:早8時(shí)腹腔注射生理鹽水約2ml,第5-7天每天早8時(shí)灌胃給予含5%DMSO的生理鹽水。(2)Rutin組:早8時(shí)腹腔注射生理鹽水約2ml,第5-7天每天早8時(shí),灌胃給予蘆丁溶液(150mg/kg)。(3)HgCl_2組:早8時(shí)腹腔注射HgCl_2鹽溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8時(shí)灌胃給予含5%DMSO生理鹽水。(4)HgCl_~(2+)Rutin組:早8時(shí)腹腔注射HgCl_2鹽溶液(1.5mg/kg),第5-7天每天早8時(shí)灌胃給予蘆丁溶液(150mg/kg)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)周期為4天。最后一次給予蘆丁后,禁食約8小時(shí)后稱量體重,腹腔注射苯巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉后,打開腹腔抽取腹主動(dòng)脈血,并去除肝臟、腎臟稱重并記錄。大生化儀檢測血清ALT、AST、ALB等評價(jià)肝功能的指標(biāo)。采用DHE探針檢測肝冰凍切片ROS的水平,利用試劑盒檢測肝組織GSSG含量和MDA水平評價(jià)氧化應(yīng)激損傷。試劑盒檢測肝CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)水平,評價(jià)蘆丁對HgCl_2導(dǎo)致肝抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá)水平,評價(jià)蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)變化的影響。最后通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平的變化。2、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)腎損傷影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn):動(dòng)物分組及處理同前。最后一次給藥結(jié)束后,禁食8小時(shí),稱量動(dòng)物體重,處死動(dòng)物并稱其腎重。血清UREA、CRE等腎功能的指標(biāo)采用大生化儀檢測。腎冰凍切片ROS的水平,采用DHE探針檢測。利用試劑盒檢測氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo),GSSG含量和MDA水平。試劑盒檢測CAT、T-SOD和Cu-ZnSOD活力以及GSH含量、GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)水平,評價(jià)蘆丁對HgCl_2導(dǎo)致腎抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá)水平,評價(jià)蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)變化的影響。最后通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平的變化。3、Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)肝損傷體外實(shí)驗(yàn):L02細(xì)胞暴露于1-150μM的HgCl_2處理3、4、5、6、7、8小時(shí),誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。MTT檢測細(xì)胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細(xì)胞凋亡。采用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。4、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用的體外實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分組:Con,Ru,HgCl_2,20μMRu+HgCl_2,40μMRu+HgCl_2,60μMRu+HgCl_2。L02細(xì)胞先給于不同濃度蘆丁20μM、40μM、60μM,預(yù)處理12小時(shí),再暴露于60μM的HgCl_2,處理6小時(shí),觀察蘆丁的保護(hù)作用。MTT檢測細(xì)胞活力。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測肝細(xì)胞凋亡。DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位(MMP)。用活體細(xì)胞線粒體膜孔通道熒光檢測試劑盒檢測細(xì)胞線粒體膜孔通道活性(MPTP)。試劑盒檢測GSSG含量和MDA水平,評價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。試劑盒檢測CAT和T-SOD活力、GSH含量以及GSH/GSSG比值,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá),評價(jià)蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)肝細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)改變的影響。Western Blot檢測凋亡家族蛋白表達(dá),評價(jià)蘆丁對HgCl_2誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平變化的影響。通過Western Blot檢測Akt和Erk的磷酸化水平。使用PI3K和Erk的抑制劑LY294002和U0126后,MTT檢測細(xì)胞活力,Western Blot檢測相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)及凋亡家族蛋白表達(dá)水平,明確蘆丁是通過激活A(yù)kt和Erk的磷酸化,增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能,抑制凋亡發(fā)生,發(fā)揮對HgCl_2導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。【結(jié)果】1、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)大鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用。蘆丁改善了HgCl_2導(dǎo)致的大鼠體重增加的減少、肝體比增加;改善了HgCl_2誘導(dǎo)的肝功能、氧化應(yīng)激損傷;提高了相關(guān)抗氧化蛋白的表達(dá)以及抗氧化酶的含量與活力;改善了肝內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變;蘆丁在一定程度上改善了HgCl_2導(dǎo)致的大鼠肝組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。2、蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)大鼠腎損傷有一定的保護(hù)作用。蘆丁改善了HgCl_2導(dǎo)致的大鼠體重增加的減少、腎體比增加;改善了HgCl_2誘導(dǎo)的腎功能的改變、氧化應(yīng)激損傷;提高了抗氧化蛋白的表達(dá)及抗氧化酶的含量與活力;改善了腎內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變;蘆丁在一定程度上改善了HgCl_2導(dǎo)致的大鼠腎組織內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。3、Hg~(2+)(HgCl_2)處理L02細(xì)胞,在一定濃度范圍內(nèi)能劑量依賴性降低細(xì)胞活力下降,劑量依賴性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加、活性氧水平升高,并建立良好的肝細(xì)胞損傷模型。4、蘆丁預(yù)處理能夠減輕Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。蘆丁預(yù)處理能夠改善HgCl_2導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低,與HgCl_2損傷組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);還可抑制HgCl_2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加(P0.05);緩解CAT、GSH、T-SOD等的活性/含量的降低(P0.05);SOD2、CAT、Nrf2的蛋白表達(dá)水平升高,增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能。5、蘆丁預(yù)處理能夠抑制Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。蘆丁預(yù)處理顯著抑制HgCl_2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,與HgCl_2組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);蘆丁預(yù)處理導(dǎo)致Bcl2的表達(dá)水平上升,Bax表達(dá)水平下降,Bax/Bcl2比值降低,與HgCl_2組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Caspase3表達(dá)水平也有所下降。6、蘆丁預(yù)處理能夠改善Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體功能障礙。蘆丁預(yù)處理改善了HgCl_2誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的下降和線粒體膜孔通道活性的降低。7、蘆丁預(yù)處理改善了Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ERK和Akt磷酸化水平的降低。蘆丁預(yù)處理后,肝細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平與HgCl_2相比顯著升高(P0.05),Akt磷酸化水平與HgCl_2組相比亦有所改善,但不顯著。8、ERK抑制劑(U0126)和PI3K抑制劑(LY294002)可在一定程度上消除蘆丁對Hg~(2+)(HgCl_2)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞活力下降的改善作用。U0126、LY294002前處理細(xì)胞組,抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)降低,與蘆丁預(yù)處理組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與HgCl_2組Bcl2的表達(dá)相當(dāng);BAX/Bcl2比值,與蘆丁處理組相比顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用ERK和PI3K抑制劑前處理細(xì)胞組,SOD1、SOD2及CAT的蛋白表達(dá)水平與蘆丁預(yù)處理相比有所降低,與HgCl_2組三類蛋白的表達(dá)水平基本一致。即蘆丁可通過激活ERK、Akt信號分子磷酸化,增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能,抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對HgCl_2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用�！窘Y(jié)論】1、HgCl_2可破壞機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng),導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷,凋亡發(fā)生。2、HgCl_2可在一定程度上抑制ERK和Akt磷酸化,參與組織及細(xì)胞損傷。3、蘆丁可增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能、減少ROS產(chǎn)生,提高抗氧化酶活性,減緩組織損傷及細(xì)胞凋亡。4、蘆丁可能通過激活ERK和Akt磷酸化,增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)功能,緩解器官損傷及凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R114
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本文編號：1503142