本文關(guān)鍵詞： Pb~(2+) 鈣離子 SOC 細(xì)胞凋亡 HEK293　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 鉛在環(huán)境中大量存在,廣泛分布,已經(jīng)成為常見(jiàn)的工業(yè)和環(huán)境毒物。鉛被用做汽油添加劑,導(dǎo)致了嚴(yán)重的大氣污染,鉛還作為增白劑使用于化妝品等。鉛在工業(yè)上是一種重要的化學(xué)物質(zhì),而在人體內(nèi)卻是一種有害的物質(zhì)。眾多的研究表明鉛對(duì)人體健康可產(chǎn)生持續(xù)的、慢性損傷。近年來(lái),環(huán)境污染特別是鉛的污染受到社會(huì)各界的廣泛重視,其導(dǎo)致的疾病及致病機(jī)制是我們關(guān)注的熱點(diǎn),人們致力于防治鉛毒害,減少或減輕鉛毒害。 細(xì)胞凋亡是在人和動(dòng)物的多種組織中發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程,可在機(jī)體的正常生理過(guò)程中存在,與生長(zhǎng)、分化同樣重要,是當(dāng)今生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中的新興課題與熱點(diǎn)。目前的研究表明,金屬元素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,并表現(xiàn)出與凋亡具有較為復(fù)雜的關(guān)系。因此近年來(lái)有關(guān)金屬元素與細(xì)胞凋亡的研究日益受到重視。 細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高或下降可引起一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng),如神經(jīng)遞質(zhì)分泌、骨骼肌收縮等快速反應(yīng),以及細(xì)胞分化、有絲分裂、細(xì)胞凋亡等慢速反應(yīng)。研究顯示,無(wú)論是在早期還是晚期細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高都有促細(xì)胞凋亡作用。 [Ca2+]i升高導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不十分清楚,可能與下列途徑有關(guān)：(1)導(dǎo)致DNA損傷：首先,[Ca2+]i升高可通過(guò)激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶,導(dǎo)致DNA的斷裂。其次[Ca2+]i升高可能通過(guò)某些機(jī)制(如組蛋白I重新分布和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活化)而影響染色體的結(jié)構(gòu),使之出現(xiàn)解折疊,扭轉(zhuǎn)張力減低和超螺旋構(gòu)象的改變,而使DNA易于被DNase降解。(2)作用于非DNA結(jié)構(gòu)：如激活蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶,前者可進(jìn)一步激活或修飾細(xì)胞骨架蛋白和某些蛋白激酶,導(dǎo)致細(xì)胞骨架的降解；后者正常時(shí)在胞質(zhì)蛋白和膜結(jié)合蛋白間起交聯(lián)作用,凋亡時(shí)活性增高,尤以凋亡小體中增高最明顯,不僅與凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化有關(guān),而且可能通過(guò)交聯(lián)而形成的鋼性網(wǎng)架,使質(zhì)膜的抗溶解能力增強(qiáng),從而保持細(xì)胞膜的完整性,防止細(xì)胞內(nèi)容物的外漏。 鈣池操縱的通道(store-operated calcium channels, SOCs)廣泛存在于非興奮性細(xì)胞膜上,是胞外內(nèi)流的主要通道之一,參與多種病理和生理過(guò)程。SOCs的研究對(duì)于進(jìn)一步完善非興奮性細(xì)胞的鈣通道特性及其調(diào)節(jié)機(jī)制的理論具有重要意義,并為臨床解決諸如肝細(xì)胞鈣超載等難題提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),因此受到越來(lái)越廣泛的重視。積極尋找和應(yīng)用SOCs的特異性工具藥,不但對(duì)非興奮性細(xì)胞SOCs的鑒定和深入研究非常必要,而且將為開(kāi)發(fā)一類非興奮性細(xì)胞的特異性鈣拮抗劑奠定基礎(chǔ)。 因此,本研究主要探討乙酸鉛(Lead acetate)處理體外培養(yǎng)細(xì)胞,觀察其對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞是否通過(guò)SOCs影響鈣紊亂從而發(fā)揮毒性效應(yīng),為進(jìn)一步研究鉛毒性的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)。 方法 1.將人胚胎腎細(xì)胞HEK293置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別以O(shè)、50、100、200、500μM鉛(Pb2+)處理細(xì)胞24小時(shí)后,使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同濃度組細(xì)胞凋亡變化情況。 2.用hoechst33342染色方法檢測(cè)鉛處理人胚胎腎細(xì)胞HEK293后細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化情況。 3.不同濃度鉛處理細(xì)胞24小時(shí)后,應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè),不同濃度組胞內(nèi)Pb2+含量。 4.使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM),記錄細(xì)胞在鉛刺激下,胞質(zhì)及細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的變化情況。 結(jié)果 1.不同濃度鉛(Pb2+)誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡率的影響 分別以0、50、100、200、500μM鉛(Pb2+)處理HEK293細(xì)胞24小時(shí)后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,各濃度組Pb2+處理24小時(shí)后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比顯著升高(P0.01)。以上結(jié)果表明,Pb2+可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡,并具有劑量反應(yīng)關(guān)系。 2.鉛(Pb2+)誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 用hoechst33342染色方法檢測(cè)鉛處理HEK293細(xì)胞后細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果顯示100μMPb2+作用HEK293細(xì)胞24小時(shí)后,HEK293細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的核濃縮、染色質(zhì)片段等細(xì)胞凋亡的特征性表現(xiàn),并形成典型的凋亡小體。 3.不同濃度Pb2+處理HEK293細(xì)胞,進(jìn)入胞內(nèi)的Pb2+含量測(cè)定 Pb2+進(jìn)入細(xì)胞的方式與Ca2+相似,我們的研究證明,應(yīng)用ICP-MS法檢測(cè)不同濃度的鉛處理組,胞內(nèi)鉛含量與胞外鉛處理組呈濃度依賴性。然而使用SOC的抑制劑2-APB顯著降低鉛的進(jìn)入量。 4.不同條件下,胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中游離Ca2+變化情況 在胞外有鈣的情況下,用不同濃度的Pb2+刺激HEK293細(xì)胞,用激光掃描共聚焦實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胞質(zhì)中游離Ca2+發(fā)現(xiàn),隨著胞外Pb2+的升高,胞質(zhì)中游離Ca2+的升高幅度也相應(yīng)增高,且呈濃度依賴性。 在胞外有鈣的情況下,使用SOC的阻斷劑2-APB預(yù)孵后,再用100μMPb2+刺激發(fā)現(xiàn),2-APB孵育組與對(duì)照組相比,胞質(zhì)中游離Ca2+增幅度明顯減小,說(shuō)明胞質(zhì)中游離Ca2+增加可能來(lái)自胞外游離鈣。 在胞外有鈣和無(wú)鈣的情況下,分別用100μM Pb2+刺激發(fā)現(xiàn),胞外無(wú)鈣組與胞外有鈣組相比,胞質(zhì)中游離Ca2+增幅度下降,也說(shuō)明胞質(zhì)中游離Ca2+增加可能來(lái)自胞外游離鈣。 在胞外無(wú)鈣的情況下,同樣用100μM Pb2+刺激細(xì)胞,監(jiān)測(cè)鈣庫(kù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中游離Ca2+濃度變化發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中游離Ca2+濃度明顯下降,說(shuō)明鈣庫(kù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的游離Ca2+外排,使得胞質(zhì)中游離Ca2+濃度增加。 結(jié)論 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Pb2+可誘導(dǎo)非興奮性HEK293細(xì)胞胞質(zhì)中游離Ca2+的濃度升高,可能通過(guò)鈣庫(kù)鈣的釋放,且激活胞外鈣離子的內(nèi)流而導(dǎo)致的,即通過(guò)SOC通路使得胞外鈣內(nèi)流,再加上胞外鉛離子的進(jìn)入,共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。說(shuō)明SOC介導(dǎo)的細(xì)胞外鈣、鉛內(nèi)流在Pb2+誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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