本文關(guān)鍵詞： 重組TNF-α人源單克隆抗體 毒性靶器官 長期毒性 免疫毒性 胸腺萎縮 脾臟萎縮 重組TNF-α人源單克隆抗體 T細(xì)胞發(fā)育 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞增殖　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分重組TNF-α人源單克隆抗體的長期毒性研究 目的：本實驗觀察食蟹猴皮下注射重組TNF-α人源單克隆抗體，每周一次，連續(xù)四周的毒性相關(guān)反應(yīng)，和停藥四周后恢復(fù)的情況。方法：30只正常食蟹猴隨機(jī)按體重分為5個組：溶媒對照組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。每個劑量組6只動物，雌雄各3只。低、中、高劑量組分別給予10.0、33.0和200.0mg/kg的重組TNF-α人源單克隆抗體；陽性對照組給予33.0mg/kg的阿達(dá)木單抗（HUMIRA）；溶媒對照組給予重組TNF-α人源單克隆抗體空白溶液。各組動物按體重皮下注射給藥，給藥體積4ml/kg，每周給藥一次，共4次，恢復(fù)期四周。觀察癥狀和檢測指標(biāo)包括：（1）一般癥狀及指標(biāo)：觀察食蟹猴的外觀，皮毛，行為，活動，步態(tài)，精神，食欲，有無流涎，惡心，大、小便，嘔吐，有無死亡、震顫等。一般指標(biāo)包括體重、肛溫、呼吸、瞳孔共4項。（2）血液學(xué)指標(biāo)：粒細(xì)胞（NEUT）、嗜酸性細(xì)胞（EOS）、嗜堿性細(xì)胞（BASO）、大未染色細(xì)胞（LUC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板（PLAT）計數(shù)、凝血酶時間（TT）、紅細(xì)胞平均容積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、單核細(xì)胞（MONO）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間(PT)、淋巴細(xì)胞（LYMPH）、紅細(xì)胞（RBC）計數(shù)、白細(xì)胞（WBC）計數(shù)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（RETIC）、血紅蛋白（HGB）定量和血漿纖維蛋白原（FIB）共19項[1]。（3）血液生化指標(biāo)：血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、肌酐（CREA）、堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽固醇（Tch）、尿素（BU）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、總蛋白（TP）、肌酸磷酸激酶（CPK）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿酸（UA）、血清鈣（Ca）、甘油三脂（TG）、血清磷（P）、血清鉀（K）、鈉（Na）和氯（Cl）共檢測20項[2]。（4）尿液檢查項目[1]：pH、蛋白質(zhì)、酮體、比重、紅細(xì)胞、葡萄糖、白細(xì)胞、亞硝酸鹽、尿膽原和膽紅素。（5）骨髓檢查：解剖的全部食蟹猴取胸骨進(jìn)行骨髓細(xì)胞計數(shù)及分類。（6）病理學(xué)檢查：給藥和觀察期結(jié)束后解剖，需要當(dāng)場稱重的器官有心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮和卵巢，需要進(jìn)行觀察是否有病變的器官有給藥部位、腦（大腦、小腦、腦干）、垂體、眼球、視神經(jīng)、頜下腺、甲狀腺、甲狀旁腺、脊椎（頸、胸、腰段）、胸骨、氣管、食管、主動脈、心臟、胸腺、肺臟、肝臟、胃、腎上腺、腎臟、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、脾臟、胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)、前列腺、膀胱、睪丸、附睪、子宮、卵巢、乳腺、大腸（結(jié)腸、直腸、盲腸）[2]。結(jié)果：（1）藥物對食蟹猴的體重、肛溫、呼吸和瞳孔無明顯影響。（2）藥物引起RBC、HGB、HCT降低，RETIC%升高，恢復(fù)期時可恢復(fù)正常，提示藥物對猴血液學(xué)指標(biāo)有一定的影響，其他血液學(xué)指標(biāo)未見與給藥相關(guān)的明顯變化。（3）藥物沒有引起血液生化指標(biāo)的明顯變化。（4）藥物對尿液指標(biāo)沒有造成一定的影響。（5）骨髓細(xì)胞檢查結(jié)果表明，藥物對食蟹猴骨髓細(xì)胞中的紅細(xì)胞系有不同程度的刺激增生作用。（6）病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，藥物引起食蟹猴胸腺和脾臟萎縮，以及胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞減少，恢復(fù)期時有恢復(fù)趨勢；藥物引起動物骨髓紅細(xì)胞系輕度增生，恢復(fù)期結(jié)束，，各組未見明顯病理改變。結(jié)論：重組TNF-α人源單克隆抗體長期給藥對食蟹猴有明顯的免疫毒性，能夠引起免疫器官胸腺和脾臟的萎縮；藥物可能存在血液系統(tǒng)毒性，可能引起機(jī)體貧血；藥物對免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的毒性作用可逆。 第二部分重組TNF-α人源單克隆抗體免疫毒性機(jī)制研究 目的：探討重組TNF-α人源單克隆抗體引起食蟹猴胸腺和脾臟萎縮的可能機(jī)制。方法：食蟹猴皮下注射重組TNF-α人源單克隆抗體10.0、33.0和200.0mg/kg，陽性對照組皮下注射33.0mg/kg的阿達(dá)木單抗（HUMIRA），溶媒對照組皮下注射等體積的重組TNF-α人源單克隆抗體空白溶液，每周給藥一次，連續(xù)四周，恢復(fù)期四周。給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束進(jìn)行下列試驗：（1）重組TNF-α人源單克隆抗體對食蟹猴胸腺和脾臟細(xì)胞凋亡的影響試驗；（2）重組TNF-α人源單克隆抗體對食蟹猴胸腺細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗；（3）重組TNF-α人源單克隆抗體對食蟹猴胸腺細(xì)胞增殖的影響試驗；（4）重組TNF-α人源單克隆抗體對食蟹猴胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響試驗；（5）外周血T淋巴細(xì)胞表型（CD3/CD4/CD8）測定試驗。結(jié)果：（1）胸腺細(xì)胞hoechest染色結(jié)果表明，包括陽性對照組在內(nèi)的各給藥組hoechest陽性細(xì)胞比例與溶媒對照組相比沒有明顯差異；胸腺TUNEL染色結(jié)果表明，陽性對照組及各給藥組TUNEL陽性染色細(xì)胞比例與溶媒對照組相比沒有明顯差異。以上結(jié)果提示，重組TNF-α人源單克隆抗體長期給藥未引起胸腺及脾臟細(xì)胞凋亡。（2）體外培養(yǎng)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明，重組TNF-α人源單克隆抗體將胸腺細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；（3）體外培養(yǎng)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明，重組TNF-α人源單克隆抗體引起EdU陽性細(xì)胞比例的顯著下降，表明重組TNF-α人源單克隆抗體抑制了胸腺細(xì)胞的增殖；（4）藥物對食蟹猴胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響試驗表明，阿達(dá)木單抗及各劑量的重組TNF-α人源單克隆抗體給藥后引起胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞數(shù)量的明顯減少，但CD4 CD8 、CD4+CD8+、CD4+、CD8+胸腺細(xì)胞的比例在各給藥組與溶媒對照組之間沒有明顯差異；（5）外周血T淋巴細(xì)胞表型檢測試驗結(jié)果提示，各給藥組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值均與溶媒對照組沒有顯著差異。結(jié)論：（1）重組TNF-α人源單克隆抗體引起食蟹猴胸腺和脾臟萎縮可能與其抑制細(xì)胞增殖有關(guān)，與凋亡機(jī)制無關(guān)。（2）重組TNF-α人源單克隆抗體引起胸腺細(xì)胞數(shù)量減少，但各階段胸腺細(xì)胞的比例沒有明顯變化，推測藥物影響了T細(xì)胞發(fā)育的早期，即雙陰性階段，抑制了該階段胸腺細(xì)胞的增殖，但對后繼發(fā)育階段沒有影響。這一推測需進(jìn)一步實驗驗證。
[Abstract]:Study on the Long - term Toxicity of Monoclonal Antibodies Against the Recombinant TNF - 偽 Human Source in the First Part Objective : To observe the effects of subcutaneous injection of recombinant TNF - 偽 human monoclonal antibody , once a week , four weeks of toxicity - related reactions and four weeks of withdrawal . Methods : 30 normal cynomolgus monkeys were randomly divided into 5 groups : vehicle control group , positive control group , high - dose group , middle - dose group and low - dose group . ( 3 ) Blood biochemical indexes : blood sugar ( GLU ) , total bilirubin ( TBIL ) , creatinine ( CREA ) , alkaline phosphatase ( ALP ) , alanine aminotransferase ( ALT ) , total cholesterol ( Tch ) , urea ( BU ) , albumin ( ALB ) , aspartate aminotransferase ( AST ) , total protein ( TP ) , uric acid ( UA ) , serum calcium ( Ca ) , triglyceride ( TG ) , serum phosphorus ( P ) , serum potassium ( K ) , white blood cell , nitrite , urobilinogen and bilirubin . ( 6 ) pathological examination : after the end of the dosing and observation period , organs weighing in the field are required to have heart , liver , spleen , lung , kidney , brain , adrenal gland , thymus , testis , appendix , uterus and ovary , and the organs with pathological changes need to be observed whether there are pathological organs , such as pituitary , eyeball , optic nerve , submaxillary gland , thyroid gland , parathyroid , spinal ( cervical , thoracic , lumbar ) , sternum , trachea , esophagus , aorta , heart , thymus , lung , liver , stomach , adrenal gland , kidney , small intestine ( duodenum , jejunum , ileum ) , spleen , pancreas , mesenteric lymph nodes , sciatic nerve , prostate , urinary bladder , testis , appendix , uterus , ovary , mammary gland , large intestine ( colon , rectum , cecum ) . Results : ( 1 ) There was no significant effect on the body weight , anal temperature , respiration and pupil of cynomolgus monkeys . Study on the Immune Toxicity Mechanism of the Recombinant Human Monoclonal Antibody Against TNF - 偽 in the Second Part 絀

本文編號：1477007