本文關鍵詞：塑化劑有毒代謝物MEHP誘導自噬參與胰島INS-1細胞氧化性DNA損傷機制探討　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯 DNA損傷 氧化應激 溶酶體-線粒體軸 自噬 白藜蘆醇

【摘要】：目的:鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(Mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)的有效毒性代謝產物。由于塑料產品中和日常飲食中DEHP越來越多的被使用,所以DEHP和其水解物MEHP對人體的傷害值得重視。已經有研究表明鄰苯二甲酸酯類代謝物與很多慢性疾病有關,像肥胖和二型糖尿病等。而累積DNA損傷和一些氧化性損傷與胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生都有直接關系。近年來發(fā)現(xiàn)在DNA損傷的發(fā)生過程中還會檢測到自噬的發(fā)生,自噬的出現(xiàn)對細胞是有利還是有害不是完全清楚,其間作用的信號通路也不是很明朗。白藜蘆醇作為抗氧化劑可以消除細胞內活性氧,達到化學預防的作用,對肥胖和糖尿病等慢性病有著積極的治療作用。所以在本實驗中,探究MEHP對INS-1細胞造成的DNA損傷,分析造成DNA損傷的機制途徑,同時還探究自噬的發(fā)生與DNA損傷的關系及其對細胞的影響;選用白藜蘆醇作為保護劑,觀察其在MEHP產生細胞毒性過程中的作用。方法:INS-1細胞被選為研究對象。MTT實驗用來檢測MEHP對INS-1細胞的毒性作用和對細胞生存率的影響;彗星實驗用來評定MEHP對INS-1細胞的遺傳毒性、DNA損傷水平;實時熒光定量PCR檢測INS-1細胞內DNA損傷相關基因ATM和P53的表達量變化。檢測細胞內ROS變化使用2',7'-二氯二氫熒光素熒光染料(DCFH-DA),檢測溶酶體膜穩(wěn)定性用吖啶橙(AO),檢測線粒體膜電位變化用JC-1染色,使用分光光度計和熒光顯微鏡觀察拍照。用蛋白印跡法檢測相關蛋白表達量變化。檢測白藜蘆醇和自噬抑制劑的作用都需要預先對細胞進行處理,再加MEHP作用。結果:與對照組相比,MEHP作用后INS-1細胞產生明顯的DNA損傷,表現(xiàn)為彗星實驗中細胞拖尾現(xiàn)象加劇等,MEHP還導致細胞內活性氧(ROS)水平升高、溶酶體膜穩(wěn)定性下降、溶酶體內組織蛋白酶B釋放增多、線粒體膜電位崩潰以及自噬蛋白表達增加。經白藜蘆醇預處理后上述現(xiàn)象均減輕,經自噬抑制劑預處理后自噬蛋白表達減少,細胞內ROS水平反而增多。結論:MEHP對INS-1細胞具有遺傳毒性。MEHP誘導產生的INS-1細胞DNA損傷是氧化應激造成的。MEHP誘導產生的INS-1細胞DNA損傷跟溶酶體-線粒體軸損傷有關。MEHP誘導產生INS-1細胞DNA損傷同時也誘導細胞自噬增加,而自噬對INS-1細胞在DNA損傷過程中起到一種保護作用。白藜蘆醇可以通過減輕氧化應激和恢復溶酶體-線粒體軸的穩(wěn)定性來減少MEHP對INS-1細胞造成的DNA損傷。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of mono-2-ethylhexylphthalate on mono-2-ethylhexylphthalate of phthalate. MEHP is a kind of di- (2-ethylhexylphthalate) phthalate (2-ethylhexylphthalate) phthalate of phthalate (2-ethylhexylphthalate). Due to the increasing use of DEHP in plastic products and diet. Therefore, the harm of DEHP and its hydrolysate MEHP to human body is worthy of attention. Some studies have shown that phthalate metabolites are related to many chronic diseases. Such as obesity and type 2 diabetes. Cumulative DNA damage and some oxidative damage are both directly related to insulin resistance and obesity. Autophagy has also been found in the process of DNA damage in recent years. What happened. Whether autophagy is beneficial or harmful to cells is not completely clear, and the signaling pathway is not clear. Resveratrol as an antioxidant can eliminate reactive oxygen species in cells to achieve chemoprevention. It has a positive effect on chronic diseases such as obesity and diabetes. So in this experiment, we explore the DNA damage caused by MEHP on INS-1 cells and analyze the mechanism of DNA damage. At the same time, the relationship between autophagy and DNA damage and its effect on cells were explored. Resveratrol was used as protective agent. To observe the role of MEHP in the process of cytotoxicity. Methods:. INS-1 cells were selected as the object of study. MTT assay was used to detect the toxicity of MEHP to INS-1 cells and the effect of MEHP on cell survival. Comet assay was used to evaluate the damage level of MEHP to INS-1 cells. The expression of DNA damage related genes ATM and p53 in INS-1 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The changes of ROS in INS-1 cells were detected by 2'. The stability of lysosomal membrane was detected by acridine orange (Acridine orange), and the change of mitochondrial membrane potential was stained with JC-1. Spectrophotometer and fluorescence microscope were used to observe and photograph. Western blotting was used to detect the expression of related proteins. The effects of resveratrol and autophagy inhibitor were all pre-treated. Results: compared with the control group, the DNA damage of INS-1 cells was obvious, which showed that the tail phenomenon was aggravated in comet assay. MEHP also increased the level of intracellular reactive oxygen species (Ros), decreased the stability of lysosomal membrane and increased the release of cathepsin B in lysosome. The mitochondrial membrane potential collapse and autophagy protein expression increased. After resveratrol pretreatment, the above phenomenon was alleviated, and the autophagy protein expression decreased after autophagy inhibitor pretreatment. The level of intracellular ROS increased. Conclusion:. Genotoxicity of MEHP to INS-1 cells. MEHP-induced DNA damage of INS-1 cells is induced by oxidative stress. MEHP-induced DNA damage of INS-1 cells. MEHP-induced DNA damage in INS-1 cells and increased autophagy. Resveratrol can reduce the effect of MEHP on INS- by reducing oxidative stress and restoring the stability of lysosomal mitochondrial axis. 1 DNA damage caused by cells.
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

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