本文關(guān)鍵詞：多種環(huán)境污染化學(xué)物對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞的遺傳毒作用

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【摘要】：苯作為一種環(huán)境污染物,廣泛存在于石油、汽油、香煙煙霧等物品中。它已被確認(rèn)為一種人類致癌物。人類苯暴露(例如交通警察在工作場所接觸苯)水平增高可觀察到含有微核的淋巴細(xì)胞增多。苯在各種動(dòng)物的體內(nèi)模型及職業(yè)接觸的工人中都具有遺傳毒性,但是在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型(包括加入Aroclor1254誘導(dǎo)的肝臟代謝活化系統(tǒng)時(shí)),苯都不呈現(xiàn)遺傳毒作用。與野生型小鼠比較,CYP2E1敲除的小鼠完全缺乏對(duì)苯誘發(fā)的骨髓抑制及遺傳損傷反應(yīng)；并且用人肝臟微粒體代謝系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)苯主要經(jīng)過CYP2E1的催化而被轉(zhuǎn)化為苯酚；還發(fā)現(xiàn)cDNA表達(dá)的人CYP2E1可轉(zhuǎn)化苯酚為氫醌、兒茶酚及1,2,4-三羥基苯,后三者是具有一定遺傳毒性的代謝物。本研究的目標(biāo)之一是利用重組穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞測試苯及其羥化代謝物的遺傳毒性。 作為苯的主要氧化代謝物,苯酚和氫醌在經(jīng)Ⅱ相代謝(包括硫酸基結(jié)合和葡萄糖醛酸基結(jié)合)后從體內(nèi)消除。SULT1A1是人類肝細(xì)胞表達(dá)的SULT1亞族中最優(yōu)勢的亞型,已有報(bào)道人或大鼠SULT1A1可催化苯酚、兒茶酚和氫醌的硫酸基結(jié)合反應(yīng)。但是,SULT1A1在活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與CYP2E1同時(shí)表達(dá)的條件下,兩種代謝酶在活化、滅活的拮抗作用中依不同的苯濃度有何作用特征尚無報(bào)道。我們建立了一個(gè)重組表達(dá)人CYP2E1和人SULT1A1的V79細(xì)胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1),并建立了將其中一個(gè)酶的活性進(jìn)行特異化學(xué)抑制而觀察另一個(gè)酶作用的模型。本研究擬觀察苯及其一系列羥化及氧化代謝物對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞誘發(fā)微核的作用,以及其作用的代謝酶相關(guān)性,以進(jìn)一步探討苯的代謝對(duì)其遺傳毒性的影響。 多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一類持久性環(huán)境污染物,至今在國內(nèi)外環(huán)境中普遍存在,在人體中也有一定負(fù)荷。很早已發(fā)現(xiàn)PCBs對(duì)動(dòng)物的致癌性,最近所有12種二嗯英類似PCBs(分子中含4個(gè)以上氯原子)經(jīng)IARC確認(rèn)為人類致癌物。一般認(rèn)為高氯化PCBs在體內(nèi)代謝速率很低,因此由代謝活化產(chǎn)生遺傳毒性的可能較低,低氯化PCBs則存在相對(duì)活潑的代謝,可能具有遺傳毒作用,但迄今尚無有力證據(jù)。CYP2E1也可被PCBs強(qiáng)烈誘導(dǎo),同時(shí),CYP2E1能催化許多小分子外源性化合物的代謝,包括苯、苯酚、醋氨酚及某些短鏈鹵代脂肪烴；因此我們猜測人CYP2E1有催化某些PCBs化合物代謝活化的可能。為探究這一猜想的真實(shí)性,本研究團(tuán)隊(duì)前期工作探討了多種PCBs在表達(dá)人CYP2E1的V79細(xì)胞誘發(fā)微核和基因突變的作用,結(jié)果顯示多種二氯聯(lián)苯化合物具有強(qiáng)烈的CYP2E1依賴性遺傳毒作用。為進(jìn)一步探討三氯與四氯聯(lián)苯的遺傳毒性,本課題選擇與兩種強(qiáng)作用二氯聯(lián)苯(PCB5和PCB4)結(jié)構(gòu)相關(guān)的一系列三氯聯(lián)苯,以及環(huán)境和人體相對(duì)高水平暴露的一系列四氯聯(lián)苯,觀察其誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULTlA1細(xì)胞誘發(fā)微核的作用、作用的酶相關(guān)性以及化學(xué)物結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。 1-甲基芘(1-MP)是環(huán)境中常見的多環(huán)芳烴化合物。已有研究表明其羥化代謝物1-羥甲基芘(1-HMP)可對(duì)表達(dá)人或大鼠SULT1AK、1C1、2A1的鼠傷寒沙門氏菌；并且1-MP可由多種人或大鼠細(xì)胞色素P450酶系(包括CYP2E1)的催化形成1-HMP。然而,1-MP的完整代謝活化過程及其對(duì)真核細(xì)胞的染色體的作用迄今未見報(bào)道。本研究在我們已證實(shí)1-HMP的遺傳毒性及其SULT1A1依賴性基礎(chǔ)上(另一研究生論文有介紹),進(jìn)一步探討其原型化合物1-MP對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1誘發(fā)微核和Hprt基因座基因突變的作用。 目的 1.研究人CYP2E1和人SULT1A1對(duì)苯及其羥化代謝物誘發(fā)微核作用的影響。 2.探討三氯、四氯聯(lián)苯代謝活化、遺傳毒性及其與人CYP2E1和人SULT1A1的關(guān)系。 3.進(jìn)一步揭示1-MP代謝活化相關(guān)的對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒作用。 方法 1.MTT試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖和活性的測定 MTT名為噻唑藍(lán),是一種黃顏色的染料。活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT,同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下,生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲佨(Formazan),甲佨的多少可以用酶標(biāo)儀在570nnm處進(jìn)行測定。在通常情況下,甲佨生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比,因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)V79-hCYP2El-hSULT1A1細(xì)胞按6800/孔接種于96孔板中,SULT1A1抑制劑五氯酚(PCP,10μmol/L)、CYP2E1抑制劑1-氨基苯三唑(ABT,20、60或200μmol/L)或二甲基亞砜(對(duì)照)于22h直至試驗(yàn)終點(diǎn)(48h)存在于培養(yǎng)液中。各受試物于24h至30h或24h至36h存在于培養(yǎng)液中。48h加5mg/LMTT,于4h換二甲基亞砜溶解,于37℃震蕩10分鐘,然后用酶標(biāo)儀在570nm波長檢測其吸光度。對(duì)一部分試驗(yàn),細(xì)胞于6—22h以乙醇(0.2%)誘導(dǎo)CYP2E1穩(wěn)定的表達(dá)。 2.微核試驗(yàn) 微核試驗(yàn)是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體,在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。V79-hCYP2E1-hSULTlAl細(xì)胞按3×105/瓶接種于一系列12.5-em2培養(yǎng)瓶。酶抑制劑PCP (10μmol/L)、ABT(20或60μmol/L)或二甲基亞砜(對(duì)照)于22h直至試驗(yàn)終點(diǎn)(48h)存在于培養(yǎng)液中。各受試物于24h至30h存在于培養(yǎng)液中。每個(gè)處理組5個(gè)培養(yǎng)孔。各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞于48h以胰蛋白酶消化的方式收獲,并觀察其微核細(xì)胞率。對(duì)一部分試驗(yàn),細(xì)胞于622h以乙醇(0.2%)誘導(dǎo)CYP2E1的表達(dá)。 3.致突變試驗(yàn) 細(xì)胞在Hprt位點(diǎn)的正向突變(即獲得對(duì)6-巰基嘌呤的抗性)是本研究中觀察的遺傳毒作用終點(diǎn)之一。試驗(yàn)參照已報(bào)道過的方法,并簡略概括如下：細(xì)胞以每皿(118cm2,加入20ml培養(yǎng)液)1.0x106的密度接種,6h后加入無水乙醇(終濃度0.2%)以穩(wěn)定CYP2E1酶蛋白(在需要加入CYP2E1抑制劑的組則不加入乙醇)。于22h以新鮮培養(yǎng)液更換(除去乙醇),并分別加入各抑制劑,即ABT(20μmol/L)、PCP(10μmol/L),或二甲基亞砜(溶劑對(duì)照)。2h后,加入各受試物[以NDMA(30μmol/L)、2-MP(5μmol/L)作為陽性對(duì)照物,它們是分別依賴CYP2E1和SULT1A1的間接致突變劑],或純水(溶劑對(duì)照)。繼續(xù)培養(yǎng)3d后,各組細(xì)胞以胰蛋白酶消化收集；各組細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)占對(duì)照組細(xì)胞數(shù)的百分比作為各化合物細(xì)胞毒性的指標(biāo)。繼續(xù)以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)3d后,再一次傳代并接種細(xì)胞于含有6-巰基嘌呤(7μg/ml)的選擇性培養(yǎng)液(每個(gè)118cm2培養(yǎng)皿接種106細(xì)胞,從每個(gè)培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞被接種至4個(gè)培養(yǎng)皿),另外按100細(xì)胞/皿的密度接種細(xì)胞于3個(gè)6cm2培養(yǎng)皿并以正常培養(yǎng)液培養(yǎng),以測定細(xì)胞的克隆形成率。8d后試驗(yàn)終止,經(jīng)固定和染色,獲得每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞集落的數(shù)目,以平行接種的各培養(yǎng)皿所得均數(shù)作為相應(yīng)的觀察值(克隆形成率和突變率)。每個(gè)處理組設(shè)立2個(gè)初始培養(yǎng)瓶,各組觀察值為2個(gè)培養(yǎng)瓶相應(yīng)觀察值的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)；各組微核細(xì)胞率的比較則采用卡方檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；突變率的分析則采用確切概率(Fisher)法。 結(jié)果 1.苯、它的各個(gè)羥化代謝物和1,4-苯醌對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞均不同程度誘發(fā)微核。首次觀察到苯和苯酚在體外細(xì)胞中的遺傳毒性作用；首次觀察到人CYP2E1可繼續(xù)轉(zhuǎn)化氫醌、兒茶酚及三羥基苯為遺傳毒性增高的代謝物。維生素C可明顯降低兒茶酚、氫醌和三羥基苯對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞的誘發(fā)微核作用,但對(duì)1,4-苯醌誘導(dǎo)的微核形成無影響。 2.受試PCBs對(duì)V79對(duì)照細(xì)胞均無細(xì)胞毒作用,也不誘發(fā)微核；然而,本論文涉及的12個(gè)PCBs中有10個(gè)都對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞強(qiáng)弱不等地誘導(dǎo)細(xì)胞毒和/或微核形成,并且其作用呈現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。受試物中僅有PCB77和PCB81(為二嗯英類似的四氯聯(lián)苯)對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞未表現(xiàn)任何毒性。CYP2E1抑制劑ABT可阻斷PCBs的細(xì)胞毒作用,并降低其誘發(fā)微核的作用；而SULT1A1的抑制劑PCP則強(qiáng)化某些PCBs的作用。表明人CYP2E1是介導(dǎo)所觀察到代謝活化作用的關(guān)鍵酶。 3.1-MP對(duì)缺乏生物轉(zhuǎn)化酶的V79對(duì)照細(xì)胞均無細(xì)胞毒或遺傳毒作用。然而,它對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞呈現(xiàn)輕度細(xì)胞毒作用,并具有明顯的誘發(fā)微核與基因突變作用,后者均呈現(xiàn)濃度依賴性效應(yīng)。CYP2E1和SULT1A1的抑制劑(ABT和PCP)均可抑制1-甲基芘誘發(fā)的細(xì)胞毒、微核形成及致突變作用。 結(jié)論 (1)人CYP2E1可通過連續(xù)的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化苯直至終致突變物(可能為1,4-及1,2-苯醌)形成；苯的二羥基代謝物由人SULT1A1催化的硫酸基結(jié)合反應(yīng)可能代表苯的一個(gè)解毒途徑。氫醌、兒茶酚、三羥基苯在人CYP2E1作用下的進(jìn)一步活化可能涉及這些化合物中羥基的氧化,進(jìn)一步形成親電子性的醌類衍生物。 (2)許多三氯、四氯聯(lián)苯化合物經(jīng)人CYP2E1可活化為遺傳毒性代謝物,并呈現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。依賴于細(xì)胞內(nèi)的人CYP2E1活性,2,3,3’-三氯聯(lián)苯和2,3,4’-三氯聯(lián)苯具有最強(qiáng)的誘發(fā)微核及細(xì)胞毒作用；盡管二嗯英類似的四氯聯(lián)苯無活性,其它結(jié)構(gòu)的四氯聯(lián)苯可強(qiáng)弱不等地誘發(fā)微核。人SULT1A1對(duì)某些PCBs的活性代謝物則具有一定解毒作用。 (3)本研究證實(shí)人類CYP2E1與SULT1A1可協(xié)同作用以活化1-MP,使其在不呈現(xiàn)細(xì)胞毒作用的較低濃度即具強(qiáng)烈誘導(dǎo)基因突變與染色體畸變的作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐海燕;苯毒性作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1998年03期

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本文編號(hào)：1277671