本文關鍵詞：磁性富集熒光法快速檢測大腸桿菌的研究

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【摘要】：隨著全球工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴重。環(huán)境保護和食品安全己成為本世紀影響人類生存和發(fā)展的重要問題。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic escherichia coli, EHEC)是人類食源性以及水源性病原體,食用被該菌污染的食物會導致腹瀉和腸炎,嚴重時將導致出血性結腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥,甚至死亡。EHEC以大腸桿菌0157：H7血清型為代表菌株,呈暴發(fā)流行趨勢,且不斷發(fā)生變異。建立一種快速、準確、簡便檢測大腸桿菌的方法,對環(huán)境監(jiān)測和臨床醫(yī)學流行病學診斷有現(xiàn)實意義。因此,為了研究大腸桿菌的高靈敏快速檢測方法,本文建立了一種基于萘酰亞胺標記的DNA探針和磁性四氧化三鐵氧化石墨烯分離的大腸桿菌0157：H7檢測方法。實驗結果表明,在一定條件下,0157：H7數(shù)量的對數(shù)值和熒光強度與空白值熒光強度的比值(F/F0)呈線性關系,線性范圍150～1.5×106CFU/mL,經(jīng)過富集后檢出限可達100 CFU/mL。該方法靈敏度高,檢出限低,耗時較短,操作簡單,為致病菌的高靈敏檢測提供了新思路。本文將標記了萘酰亞胺的ssDNA(單鏈DNA)作為捕獲探針吸附在磁性氧化石墨烯表面,當目標ssDNA存在時,捕獲探針與目標ssDNA部分雜交,利用磁場將目標ssDNA捕獲并進行富集,去除原溶液,然后加入釋放探針溶液完成雜交,形成完整雙鏈,使標記了熒光的捕獲探針從磁性氧化石墨烯的表面釋放出來,通過測定溶液熒光強度可以實現(xiàn)大腸桿菌0157：H7的高靈敏檢測。本文對合成的目標DNA T和培養(yǎng)的大腸桿菌0157：H7均進行了檢測試驗,前者用來初步探索實驗的可行性并優(yōu)化實驗條件,后者作為本實驗體系的應用,對大腸桿菌的檢測進行進一步的探索。論文研究內(nèi)容和取得的研究成果主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)本實驗合成了水溶性良好、熒光強度穩(wěn)定的N-羥乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亞胺(4-N-aminoethyl-N-hydroxyethyl-1,8-naphthalimide, AHA)并將其作為磁性富集熒光法檢測大腸桿菌的熒光劑,為本實驗測量出良好的熒光信號強度提供保障。(2)使用熒光分光光度計定量測量溶液熒光強度,建立檢測大腸桿菌的新體系。以合成目標DNA為待測物,對各項實驗條件進行優(yōu)化,具體包括雜交溫度、雜交時間、吸附時間、MGN濃度、釋放探針R濃度和富集倍數(shù)。在最優(yōu)條件下,通過檢測不同濃度待測物存在時的熒光強度,研究待測物濃度和熒光強度之間的線性關系。(3)培養(yǎng)大腸桿菌0157：H7細菌溶液,通過平板菌落計數(shù)法確定其細菌數(shù)量,并用試劑盒提取其DNA,用以作為待測物,建立了對大腸桿菌檢測的新方法,并檢測該方法的靈敏度和實際應用性。
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R155.3
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本文編號：1270984