本文關(guān)鍵詞：磁性富集熒光法快速檢測(cè)大腸桿菌的研究

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【摘要】：隨著全球工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴(yán)重。環(huán)境保護(hù)和食品安全己成為本世紀(jì)影響人類生存和發(fā)展的重要問題。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic escherichia coli, EHEC)是人類食源性以及水源性病原體,食用被該菌污染的食物會(huì)導(dǎo)致腹瀉和腸炎,嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥,甚至死亡。EHEC以大腸桿菌0157：H7血清型為代表菌株,呈暴發(fā)流行趨勢(shì),且不斷發(fā)生變異。建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便檢測(cè)大腸桿菌的方法,對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)和臨床醫(yī)學(xué)流行病學(xué)診斷有現(xiàn)實(shí)意義。因此,為了研究大腸桿菌的高靈敏快速檢測(cè)方法,本文建立了一種基于萘酰亞胺標(biāo)記的DNA探針和磁性四氧化三鐵氧化石墨烯分離的大腸桿菌0157：H7檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在一定條件下,0157：H7數(shù)量的對(duì)數(shù)值和熒光強(qiáng)度與空白值熒光強(qiáng)度的比值(F/F0)呈線性關(guān)系,線性范圍150～1.5×106CFU/mL,經(jīng)過富集后檢出限可達(dá)100 CFU/mL。該方法靈敏度高,檢出限低,耗時(shí)較短,操作簡(jiǎn)單,為致病菌的高靈敏檢測(cè)提供了新思路。本文將標(biāo)記了萘酰亞胺的ssDNA(單鏈DNA)作為捕獲探針吸附在磁性氧化石墨烯表面,當(dāng)目標(biāo)ssDNA存在時(shí),捕獲探針與目標(biāo)ssDNA部分雜交,利用磁場(chǎng)將目標(biāo)ssDNA捕獲并進(jìn)行富集,去除原溶液,然后加入釋放探針溶液完成雜交,形成完整雙鏈,使標(biāo)記了熒光的捕獲探針從磁性氧化石墨烯的表面釋放出來,通過測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌0157：H7的高靈敏檢測(cè)。本文對(duì)合成的目標(biāo)DNA T和培養(yǎng)的大腸桿菌0157：H7均進(jìn)行了檢測(cè)試驗(yàn),前者用來初步探索實(shí)驗(yàn)的可行性并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,后者作為本實(shí)驗(yàn)體系的應(yīng)用,對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步的探索。論文研究?jī)?nèi)容和取得的研究成果主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)本實(shí)驗(yàn)合成了水溶性良好、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定的N-羥乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亞胺(4-N-aminoethyl-N-hydroxyethyl-1,8-naphthalimide, AHA)并將其作為磁性富集熒光法檢測(cè)大腸桿菌的熒光劑,為本實(shí)驗(yàn)測(cè)量出良好的熒光信號(hào)強(qiáng)度提供保障。(2)使用熒光分光光度計(jì)定量測(cè)量溶液熒光強(qiáng)度,建立檢測(cè)大腸桿菌的新體系。以合成目標(biāo)DNA為待測(cè)物,對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,具體包括雜交溫度、雜交時(shí)間、吸附時(shí)間、MGN濃度、釋放探針R濃度和富集倍數(shù)。在最優(yōu)條件下,通過檢測(cè)不同濃度待測(cè)物存在時(shí)的熒光強(qiáng)度,研究待測(cè)物濃度和熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。(3)培養(yǎng)大腸桿菌0157：H7細(xì)菌溶液,通過平板菌落計(jì)數(shù)法確定其細(xì)菌數(shù)量,并用試劑盒提取其DNA,用以作為待測(cè)物,建立了對(duì)大腸桿菌檢測(cè)的新方法,并檢測(cè)該方法的靈敏度和實(shí)際應(yīng)用性。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R155.3
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本文編號(hào)：1270984