發(fā)布時(shí)間：2017-12-04 11:21

  本文關(guān)鍵詞：功夫菊酯通過干擾BDNF通路抑制雌激素促海馬PSD95表達(dá)的研究

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【摘要】：研究背景功夫菊酯(lambda-cyhalothrin,LCT)是目前被廣泛應(yīng)用的一種II型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,具有神經(jīng)毒性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于行卵巢切除的青春期小鼠,LCT或雌激素(17β-Estradiol,E_2)均能夠提高小鼠海馬突觸后致密蛋白95(Post-synaptic Density 95,PSD95)的蛋白表達(dá)且改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,而當(dāng)LCT與E_2共同作用時(shí),各自的單獨(dú)效應(yīng)均不顯示。前期在培養(yǎng)原代小鼠海馬神經(jīng)元的研究中發(fā)現(xiàn),雌激素受體α(Estrogen Receptorα,ERα)介導(dǎo)的AKT通路在LCT抑制雌激素的促神經(jīng)突起生長(zhǎng)(表現(xiàn)為數(shù)目增加)和促PSD95表達(dá)中起重要作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)以及突觸發(fā)育,是E_2神經(jīng)保護(hù)的重要效應(yīng)分子。BDNF的表達(dá)受ERα-AKT、MAPK及PKA等多條信號(hào)通路調(diào)控。LCT雖然可干擾ERα-AKT通路,但并非必然影響B(tài)DNF。本課題擬探討B(tài)DNF通路是否參與到LCT干擾雌激素的神經(jīng)發(fā)育效應(yīng)中。目的:以小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22細(xì)胞為體外模型,和行卵巢切除術(shù)ICR雌鼠為體內(nèi)模型,研究BDNF通路在功夫菊酯(LCT)干擾雌激素促海馬PSD95表達(dá)以及促海馬功能中的作用。方法:以小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22細(xì)胞為模型,用LCT(50μM)、E_2(10 n M)、LCT(50μM)+Trk B FC(BDNF信號(hào)通路的抑制劑,20μg/ml)、E_2(10 n M)+Trk B FC(20μg/ml)、LCT(50μM)+ICI182 780(ERα抑制劑,1μM)、E_2(10 n M)+ICI182 780(1μM)、LCT(50μM)+E_2(10 n M)處理24h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,免疫蛋白印跡法檢測(cè)PSD95蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清和細(xì)胞的BDNF蛋白水平。對(duì)出生后28天(PND28)的雌鼠行卵巢切除術(shù)(OVX),恢復(fù)7天后,隨機(jī)分為8組,每組10只,分別為:OVX+DMSO,OVX+LCT(3.0μg/g),OVX+E_2(10.0μg/g),OVX+LCT(3.0μg/g)+K252a(BDNF信號(hào)通路的抑制劑,25μg/kg),OVX+E_2(10.0μg/g)+K252a(25μg/kg),OVX+LCT(3.0μg/g)+E_2(10.0μg/g),Sham+DMSO,Sham+LCT(3.0μg/g)。腹腔注射給藥,每天一次,連續(xù)7天,末次給藥24小時(shí)后,各組中隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮),余下部分用于免疫蛋白印跡法檢測(cè)PSD95蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)海馬中BDNF蛋白水平。結(jié)果:在HT22細(xì)胞系體外培養(yǎng)模型中,發(fā)現(xiàn)LCT處理HT22細(xì)胞24h后,出現(xiàn)類似E_2作用的效應(yīng)。LCT顯著提高HT22細(xì)胞PSD95蛋白的表達(dá),用ICI182 780后這種增強(qiáng)效應(yīng)消失。且LCT處理組與E_2處理組之間細(xì)胞PSD95表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示LCT因其擬雌激素特性影響神經(jīng)元PSD95表達(dá)。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),各處理組HT22細(xì)胞內(nèi)BDNF蛋白水平無明顯改變,而培養(yǎng)上清中BDNF蛋白有明顯差異,提示BDNF蛋白表達(dá)受到影響。對(duì)BDNF m RNA的檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)上清ELISA法檢測(cè)結(jié)果一致,說明LCT及其與E_2聯(lián)合作用可影響B(tài)DNF表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LCT具有類似E_2的促BDNF表達(dá)效應(yīng),且可被ERα的經(jīng)典核受體抑制劑ICI182 780所阻斷。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),LCT或E_2對(duì)神經(jīng)元PSD95表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)均可被BDNF受體抑制劑Trk B FC所抑制,說明BDNF在LCT和E_2對(duì)PSD95表達(dá)的影響中起到重要作用。ERα抑制劑和BDNF受體抑制劑對(duì)E_2或LCT促PSD95表達(dá)效應(yīng)的影響之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,進(jìn)一步說明BDNF通路在雌激素神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)以及LCT干擾雌激素的這種效應(yīng)中起重要作用。在ICR雌鼠OVX模型中同樣發(fā)現(xiàn)類似體外模型的效應(yīng),OVX處理顯著降低海馬PSD95和BDNF的蛋白表達(dá),OVX+DMSO組與Sham+DMSO組相比,海馬PSD95和BDNF蛋白水平明顯下降,而補(bǔ)充雌激素后這種降低效應(yīng)得以改善,OVX+E_2組與Sham+DMSO組相比無顯著差異;OVX+E_2組與OVX+DMSO組相比,海馬PSD95和BDNF蛋白明顯升高。與雌激素作用相似,LCT能夠顯著提高海馬PSD95和BDNF蛋白表達(dá),OVX+LCT組與OVX+DMSO組相比,海馬PSD95和BDNF蛋白水平明顯增加;OVX+LCT組與OVX+E_2組相比,海馬PSD95和BDNF蛋白水平無明顯差異。而BDNF受體Trk B的抑制劑K252a可抑制LCT和E_2對(duì)海馬PSD95的促進(jìn)作用,也進(jìn)一步證明BDNF在LCT和E_2對(duì)PSD95表達(dá)的影響中起到重要作用。LCT能夠明顯干擾E_2對(duì)PSD95和BDNF的促進(jìn)作用,OVX+LCT+E_2組與OVX+E_2組、Sham+LCT組與Sham+DMSO組相比,海馬PSD95和BDNF的蛋白水平明顯降低。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)OVX處理顯著減少小鼠的自主運(yùn)動(dòng)能力,OVX+DMSO組與Sham+DMSO組相比穿越總格數(shù)減少,而補(bǔ)充雌激素后這種降低效應(yīng)消失,OVX+E_2組與Sham+DMSO組相比無顯著差異,OVX+E_2組與OVX+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯增加。這充分說明雌激素能夠改善小鼠的自主運(yùn)動(dòng)能力;與雌激素作用相似,LCT單獨(dú)作用能夠顯著增加穿越總格數(shù),OVX+LCT組與OVX+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯增長(zhǎng),OVX+LCT組與OVX+E_2組相比穿越總格數(shù)無明顯差異,這說明LCT單獨(dú)作用時(shí)對(duì)小鼠的自主運(yùn)動(dòng)能力表現(xiàn)出擬雌激素效應(yīng);而BDNF受體Trk B的抑制劑K252a能夠抑制LCT和E_2的單獨(dú)效應(yīng),OVX+LCT+K252a組與OVX+LCT組相比、OVX+E_2+K252a組與OVX+E_2組相比穿越總格數(shù)明顯減少,BDNF通路在雌激素維持小鼠正常行為以及LCT干擾雌激素的這種效應(yīng)中起重要作用。在存在雌激素的狀態(tài)下,LCT能夠明顯干擾E_2對(duì)穿越總格數(shù)的影響,OVX+LCT+E_2組與OVX+E_2組、Sham+LCT組與Sham+DMSO組相比穿越總格數(shù)明顯減少。同樣,在水迷宮實(shí)驗(yàn)中OVX處理顯著延長(zhǎng)登臺(tái)潛伏期和縮短在目標(biāo)象限的時(shí)間,OVX+DMSO組與Sham+DMSO組相比登臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng),在目標(biāo)象限的時(shí)間明顯縮短,而補(bǔ)充雌激素后上述效應(yīng)消失;與雌激素作用相似,LCT單獨(dú)作用能夠顯著縮短登臺(tái)潛伏期時(shí)間和延長(zhǎng)在目標(biāo)象限的時(shí)間;BDNF受體Trk B的抑制劑K252a能夠抑制LCT和E_2的單獨(dú)效應(yīng),LCT+K252a組與OVX+LCT組、E_2+K252a組與OVX+E_2組相比登臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng),目標(biāo)象限的時(shí)間明顯縮短;LCT能夠明顯干擾E_2對(duì)登臺(tái)潛伏期和目標(biāo)象限時(shí)間的影響,OVX+LCT+E_2組與OVX+E_2組、Sham+LCT組與Sham+DMSO組相比登臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng),在目標(biāo)象限的時(shí)間明顯縮短。結(jié)論:BDNF通路在E_2促進(jìn)神經(jīng)元PSD95表達(dá)中起重要作用,雖然LCT單獨(dú)作用時(shí)具有擬E_2的效應(yīng),但LCT可通過干擾BDNF通路抑制E_2對(duì)海馬PSD95表達(dá)的促進(jìn)作用,進(jìn)而影響小鼠海馬自主活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

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