發(fā)布時(shí)間：2017-11-26 14:33

  本文關(guān)鍵詞：喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷產(chǎn)生氧化應(yīng)激及溶酶體線粒體相關(guān)機(jī)制探討

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【摘要】：目的：喹乙醇是一種人工合成的抗菌促生長(zhǎng)劑，因其具有效率高、毒性低、殘留少等特點(diǎn)，在中國(guó)作為飼料添加劑廣泛使用。喹乙醇藥物毒性作用原理和相關(guān)機(jī)制尚不明確，對(duì)藥物使用劑量范圍沒(méi)有明確規(guī)定。由于喹乙醇藥物使用不當(dāng)，大量動(dòng)物中毒死亡事件時(shí)有發(fā)生，直接或間接危及人類健康。本試驗(yàn)對(duì)喹乙醇誘導(dǎo)人胚腎HEK-293細(xì)胞毒性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和溶酶體、線粒體膜穩(wěn)定性的改變，從而探討喹乙醇對(duì)DNA鏈斷裂損傷可能遺傳毒性機(jī)制，為進(jìn)一步評(píng)估喹乙醇對(duì)人類健康的影響提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法：在本次試驗(yàn)中，選擇人胚腎HEK-293細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)并觀察喹乙醇對(duì)細(xì)胞DNA的損傷情況；WesternBlotting免疫印記技術(shù)用于檢測(cè)DNA損傷相關(guān)蛋白p53的表達(dá)水平；Real-timePT-PCR技術(shù)用于檢測(cè)DNA損傷相關(guān)基因ATM和p53的表達(dá)水平。為探討其可能的遺傳毒性機(jī)制，熒光分光光度計(jì)對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)：吖啶橙（AO）染色法用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性；2'，7'—二氫二氯熒光素（DCFH-DA）染色法用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；苯二醛(OPT)染色法用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH水平；羅丹明123(Rhodamine123)染色法用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位。地昔帕明（50μM）和N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC）（10mM）分別作為溶酶體膜穩(wěn)定性和氧化損傷的保護(hù)劑，對(duì)HEK-293細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，為探討喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷相關(guān)途徑機(jī)制提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：HEK-293細(xì)胞經(jīng)不同濃度喹乙醇（200、400、800μg/ml）藥物處理2h，試驗(yàn)結(jié)果分析得出：尾長(zhǎng)（Tail Length）分別為42.88μm，74.10μm，84.16μm；尾DNA百分含量（Tail DNA％）分別為34.06%，36.30%，50.83%；尾矩（Tailmoment）分別為15.69μm%，28.72μm%，43.95μm%，與空白對(duì)照組比較，200-800μg/ml藥物處理組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）且呈劑量依賴關(guān)系。喹乙醇（200，400，800μg/ml）作用細(xì)胞2h，與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)AO的熒光強(qiáng)度分別增加了24.66%，34.93%，48.07%（P＜0.05，P＜0.01）；濃度為800μg/ml藥物處理組ROS水平升高了67.89%（P＜0.01）；濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組GSH水平分別下降了26.92%和41.58%（P＜0.01）。喹乙醇（200，400，800μg/ml）作用細(xì)胞12h，與空白對(duì)照組比較，濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位分別下降了30.08%和44.95%（P＜0.01）；濃度為400μg/ml和800μg/ml藥物處理組p53蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），p53和ATM基因的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），呈劑量依賴關(guān)系。地昔帕明（50μM）預(yù)處理HEK-293細(xì)胞1h，與喹乙醇（800μg/ml）單獨(dú)染毒劑量組相比，細(xì)胞內(nèi)AO熒光強(qiáng)度下降了42.21%（P＜0.01）；NAC（10mM）預(yù)處理HEK-293細(xì)胞1h，與喹乙醇（800μg/ml）單獨(dú)染毒劑量組相比，ROS水平下降了36.74%（P＜0.01），而GSH水平相對(duì)升高了70.65%（P＜0.01）；兩種保護(hù)劑的干預(yù)都可以有效減輕喹乙醇引起的DNA鏈斷裂損傷，使彗星拖尾明顯減小。 結(jié)論：喹乙醇可以誘導(dǎo)人胚腎HEK-293細(xì)胞DNA損傷，使DNA損傷相關(guān)蛋白p53和損傷基因ATM、p53表達(dá)上調(diào)。喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷的作用機(jī)制與溶酶體途徑有關(guān)：喹乙醇通過(guò)改變?nèi)苊阁w膜通透性，釋放一些酸性水解酶，從而導(dǎo)致DNA損傷。地昔帕明作為酸性鞘磷脂酶的抑制劑，，通過(guò)抑制溶酶體的水解酶類，從而保護(hù)溶酶體膜穩(wěn)定性，抑制p53蛋白的表達(dá)，減輕喹乙醇誘發(fā)的DNA鏈斷裂損傷；喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與細(xì)胞內(nèi)氧化損傷有關(guān)：NAC作為一種有效的抗氧化劑，可以降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，升高GSH水平，使p53蛋白表達(dá)量減少，從而抑制喹乙醇對(duì)HEK-293細(xì)胞DNA損傷；喹乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與線粒體途徑有關(guān)：喹乙醇可以通過(guò)降低線粒體膜穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂損傷。通過(guò)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)驗(yàn)證，喹乙醇作用HEK-293細(xì)胞2h可以引起溶酶體膜穩(wěn)定性的改變并使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而線粒體膜穩(wěn)定性未發(fā)生明顯變化；藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)至12h,細(xì)胞線粒體膜穩(wěn)定性顯著下降。由此推出：喹乙醇誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷，首先使溶酶體膜遭到破環(huán)，產(chǎn)生ROS，漏出的酸性水解酶和氧化自由基共同作用線粒體，使線粒體膜穩(wěn)定性下降。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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1 張婷;陳倩;湯樹(shù)生;靳溪;鄒家杰;劉鳳英;張q

本文編號(hào)：1230150