本文關(guān)鍵詞：BNIP3在鎘神經(jīng)毒性中的作用及分子機(jī)制研究

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【摘要】：背景 鎘(Cadmium, Cd)是一種高度毒性的重金屬,主要來源于冶煉、石油燃燒、工業(yè)廢物、金屬澄清劑以及香煙等。除職業(yè)工人外,普通居民因污染的水、空氣和土壤而日益成為潛在的接觸人群。Cd能引起癌癥、腎和生殖功能障礙,以及神經(jīng)功能紊亂。Cd暴露可引起兒童的學(xué)習(xí)障礙。成人Cd作業(yè)者可表現(xiàn)出神經(jīng)性缺陷如心理反應(yīng)速度減慢；同時(shí)工人主訴平衡能力下降和注意力減退。 Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性包括細(xì)胞死亡、神經(jīng)生物化學(xué)改變(神經(jīng)遞質(zhì)和受體)和生理/行為的改變。Cd可造成兩種形式的細(xì)胞死亡：caspase依賴的凋亡和caspase不依賴的壞死樣死亡。文獻(xiàn)報(bào)道,Cd能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞同時(shí)發(fā)生凋亡及壞死樣死亡。Cd通過復(fù)雜的信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡,包括：氧化應(yīng)激,MAPKs (Mitogen-activated protein kinases)和mTOR的激活。然而在Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中,凋亡及壞死樣死亡的作用仍不清楚。此外,Cd誘導(dǎo)的壞死樣死亡的分子機(jī)制仍然未知。 BNIP3蛋白(Bcl-2and adenovirus E1B-19kDa-interacting protein3),是Bcl-2蛋白家族中BH3-only亞家族的一員,在細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。BNIP3廣泛涉及多個(gè)病理過程,例如心肌肥大和萎縮、腫瘤形成和神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺血。最新的研究發(fā)現(xiàn)BNIP3與神經(jīng)退行性疾病亨廷頓氏病(Huntington'sDisease, HD)密切相關(guān),在HD病人的肌肉細(xì)胞及HD動(dòng)物模型的腦組織中均檢出BNIP3的異常積聚。當(dāng)前,越來越多的研究結(jié)果表明BNIP3參與caspase不依賴的細(xì)胞死亡。此外,有研究顯示某些毒素如氰化物和鈷(Cobalt, Co)(?)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)BNIP3,且BNIP3參與這些毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。然而,Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中BNIP3是否發(fā)揮同樣的作用未見報(bào)道。 MAPKs是Cd誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的重要分子。MAPKs由絲氨酸-蘇氨酸激酶級聯(lián)放大信號組成。哺乳類動(dòng)物的MAPKs家族包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK), p38和c-Jun NH2端激酶(JNK)。很多研究表明MAPKs參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)變性過程。盡管MAPKs對Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有著重要作用,但其下游分子仍然未知。 目的 本研究通過聯(lián)合使用多種細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,如RNA干擾、qRT-PCR、蛋白免疫印跡、臺盼藍(lán)排斥法和PI染色等,探討B(tài)NIP3在Cd誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的作用和分子機(jī)制。 方法 1.我們選擇SH-SY5Y和PC12細(xì)胞為研究對象。采用臺盼藍(lán)排斥法檢測不同Cd濃度條件下神經(jīng)細(xì)胞的死亡率。 2.Cd處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后使用免疫印跡法檢測caspase-3和PARP蛋白的表達(dá)。預(yù)先使用pan-caspase抑制劑(zVAD-fmk)或兩個(gè)壞死抑制劑(Necrox-2和Necrox-5)處理神經(jīng)細(xì)胞,然后加入Cd處理神經(jīng)細(xì)胞12h。通過臺盼藍(lán)染色及檢測培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量,計(jì)算各組死亡率。 3.分別使用qRT-PCR和免疫印跡,檢測Cd處理的神經(jīng)細(xì)胞BNIP3基因和蛋白的表達(dá)。 4.通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的siRNA,下調(diào)BNIP3表達(dá)。RNAi下調(diào)BNIP3表達(dá)后,Cd處理神經(jīng)細(xì)胞24h。通過臺盼藍(lán)排斥法檢測Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率；通過共聚焦顯微鏡檢測并計(jì)算PI陽性細(xì)胞數(shù)；檢測培養(yǎng)基中LDH含量。 5.分別使用Cd或Co處理神經(jīng)細(xì)胞,通過免疫印跡檢測HIF-1α蛋白的表達(dá),通過qRT-PCR檢測血管內(nèi)皮生成因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)基因的表達(dá)。 6.使用免疫印跡檢測Cd處理細(xì)胞不同時(shí)間的MAPKs激活情況。 7.預(yù)先使用MEK (ERK的上游激酶)抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125或p38抑制劑SB203580處理細(xì)胞30分鐘,然后加入Cd處理神經(jīng)細(xì)胞24h。使用免疫印跡檢測BNIP3蛋白的表達(dá)及caspase-3的活化,通過臺盼藍(lán)排斥法檢測細(xì)胞死亡率。 8.構(gòu)建小鼠Cd染毒模型。將20只雄性BALB/c鼠隨機(jī)分成對照組及Cd處理組(10只/組)。Cd處理組小鼠每天接受腹腔注射氯化鎘溶液(生理鹽水溶解,lmg/Kg體重),對照組注射等量的生理鹽水,連續(xù)注射2周。收集小鼠腦組織,使用Quadrupole ICP-MS儀器檢測Cd濃度,同時(shí)使用免疫印跡檢測BNIP3蛋白的表達(dá)及MAPKs的激活。 9.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理。兩組均數(shù)比較用Independent-samples t Test。多組樣本均數(shù)比較,使用One-way ANOVA方差分析。如果方差齊多重比較采用LSD方法檢驗(yàn),若方差不齊多重比較采用Dunnett's T3, P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.臺盼藍(lán)排斥法結(jié)果顯示Cd處理細(xì)胞24h后,兩個(gè)細(xì)胞均有不同程度的死亡發(fā)生,且呈現(xiàn)濃度依賴性,死亡率隨著濃度的升高而增加。 2.Cd誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞caspase-3和PARP蛋白的活化。100μM zVAD-fmk預(yù)處理可明顯降低cleaved caspase-3的表達(dá),卻僅能輕微抑制Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。0.3μM Necrox-2或0.1μM Necrox-5(兩種壞死抑制劑)處理細(xì)胞并不影響cleaved caspase-3的表達(dá),但能顯著減少Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,且其抑制作用較zVAD-fmk組更為明顯(p0.01)。同時(shí),Necrox-2或Necrox-5可抑制Cd暴露的神經(jīng)細(xì)胞LDH的釋放,且Necrox-2/5的抑制作用顯著大于zVAD-fmk組(p0.05)。 3.Cd濃度及時(shí)間依賴地誘導(dǎo)BNIP3基因的表達(dá)。其中20μM的Cd處理細(xì)胞12h即出現(xiàn)BNIP3基因的表達(dá)上升,并持續(xù)升高至48h。與BNIP3基因表達(dá)相似,Cd強(qiáng)烈誘導(dǎo)BNIP3蛋白的表達(dá),且呈現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴性。此外,Co增加了BNIP3蛋白表達(dá),其蛋白的條帶模式與Cd處理相似。 4.與轉(zhuǎn)染空白siRNA組比較,轉(zhuǎn)染siRNA-1、2及3對Cd誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)抑制作用小,而轉(zhuǎn)染siRNA-4顯著降低Cd誘導(dǎo)的BNIP3蛋白表達(dá)(抑制率約為95%)。此外,siRNA-4能濃度依賴地抑制Cd誘導(dǎo)的BNIP3表達(dá)。重要的是,轉(zhuǎn)染siRNA-4亦能濃度依賴地降低Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡,分別降低35.04%、49.03%及61.34%。 5.與細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)相似,干擾BNIP3表達(dá)可降低Cd誘導(dǎo)的PI陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的釋放量。然而干擾BNIP3表達(dá)并不改變Cd誘導(dǎo)的cleaved caspase-3的表達(dá)。 6.作為陽性對照的Co能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)HIF-1α蛋白,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。然而,Cd在任意時(shí)間都無法誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)。VEGF是HIF-1α公認(rèn)的下游靶基因。Co處理神經(jīng)細(xì)胞能顯著上調(diào)VEGF的基因表達(dá),然而Cd處理細(xì)胞卻未能達(dá)到同樣的效果。 7.Cd激活MAPKs。Cd處理的神經(jīng)細(xì)胞磷酸化ERK、p38和JNK增加,且各激酶的激活呈現(xiàn)不同的時(shí)間效應(yīng)。ERK在1h達(dá)到峰值,隨后8h逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。P38隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),并持續(xù)上升至8h。磷酸化的JNK到4h才出現(xiàn)激活,且4h即達(dá)到峰值水平。 8.ERK抑制劑U0126能明顯抑制Cd誘導(dǎo)的BNIP3上調(diào)及細(xì)胞死亡。JNK抑制劑SP600125顯示出相似的效果。然而P38抑制劑SB203580對Cd誘導(dǎo)的BNIP3表達(dá)無影響,卻升高了Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同時(shí),ERK抑制劑U0126能明顯抑制Cd誘導(dǎo)的cleaved caspase-3表達(dá)。JNK抑制劑SP600125對cleaved caspase-3表達(dá)影響不明顯。相反,P38抑制劑SB203580能增強(qiáng)Cd誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的cleaved caspase-3表達(dá)。 9.Cd暴露組的小鼠腦組織Cd濃度顯著高于對照組。更為重要的是,Cd暴露可誘導(dǎo)小鼠的皮層及海馬組織表達(dá)BNIP3蛋白。這些組織的MAPKs亦被激活。 結(jié)論 1.Cd誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死樣死亡,其中壞死樣死亡是主要的死亡方式。 2.本文首次報(bào)道了Cd強(qiáng)烈誘導(dǎo)離體神經(jīng)細(xì)胞及活體腦組織BNIP3基因及蛋白表達(dá)。 3. BNIP3介導(dǎo)Cd誘導(dǎo)的壞死樣死亡,而非凋亡。 4.Cd誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡中,BNIP3的表達(dá)與HIF-1通路無關(guān)。 5.Cd在離體及活體水平誘導(dǎo)MAPKs的激活。其中ERK和JNK通過調(diào)控BNIP3表達(dá)參與Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。P38通過抑制caspase-3表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞存活,且與BNIP3的表達(dá)無關(guān)。 綜上所述,本研究證明BNIP3介導(dǎo)Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞壞死樣死亡。ERK和JNK是其重要的上游調(diào)控分子。結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),本文結(jié)果為進(jìn)一步的神經(jīng)毒性機(jī)制研究及發(fā)展新的防治方法奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
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本文編號：1229492