本文關鍵詞：鈣蛋白酶抑制劑對丙烯酰胺致神經干細胞損傷的干預及機制

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【摘要】：目的丙烯酰胺(Acrylamide, ACR)是一種被廣泛應用于工業(yè)生產的化工原料,除生產和使用ACR過程中的職業(yè)暴露外,淀粉類食品在高溫(120℃)烹調下也可產生微量ACR。動物實驗和人群流行病學資料均已表明,ACR中毒以對神經系統(tǒng)的損害為主,引起感覺-運動型周圍及中樞神經病變,ACR的神經毒性已被人們所認識。相關研究報道,ACR可對神經絲(Neurofilaments, NFs)造成損傷,病理結果顯示ACR中毒模型軸突腫脹、NFs堆積。NFs是神經元細胞骨架的主要成分,由NF-L、NF-M、NF-H三種亞單位組成,其中任何一種NFs亞單位表達缺失或者表達過度,都可導致NFs結構或功能紊亂,引起軸漿運輸發(fā)生改變,形成軸索病。ACR還可介導神經組織細胞內Ca2+濃度升高,細胞內Ca2+濃度超載可激活鈣蛋白酶(Calpain)活性。但是上述改變之間的聯(lián)系及發(fā)病機制,尚未研究清楚。假設ACR引起NFs改變與Calpain活性發(fā)生改變有關,本實驗以神經干細胞(Neural Stem Cells, NSCs)為實驗對象,建立ACR中毒及鈣蛋白酶抑制劑(Calpeptin, CP)干預模型,測定細胞內Ca2+濃度、Calpain活性,以及NFs含量的變化,探討ACR神經中毒的發(fā)病機制,為預防和治療ACR中毒提供理論依據(jù)。方法1. NSCs的原代培養(yǎng)及鑒定無菌條件下,取出生24h內Wistar大乳鼠的脊髓背根神經節(jié)(Dorsal Root Ganglion, DRG)進行體外細胞原代培養(yǎng)。采用免疫熒光化學染色法檢測NSCs特異性表達物巢蛋白(Nestin),神經元特異性表達物神經元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE),神經膠質細胞特異性表達物膠質纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)進行NSCs鑒定。2.ACR中毒及CP干預模型的建立MTT法測定0D值,計算細胞存活率,逐步確定ACR中毒劑量與CP干預劑量,建立ACR中毒及CP干預模型。3.細胞內Ca2+濃度及Calpain活性的測定Fura-2/AM探針負載法和Calpain Substrate Ⅱ底物剩余法分別測定細胞內Ca2+濃度及Calpain活性。4.NFs含量的測定聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印跡法(Western Blotting)測定NFs含量。5.統(tǒng)計處理采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,多組之間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用Dunnett-t檢驗(方差齊)和Games-Howell檢驗(方差不齊)進行比較,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1. NSCs的原代培養(yǎng)及鑒定NSCs的原代細胞經體外培養(yǎng),細胞貼壁生長旺盛,7-10d可長滿25cm2細胞培養(yǎng)瓶底部。免疫熒光化學染色法結果顯示, 原代培養(yǎng)的NSCs Nestin染色呈陽性,且純度可達90%以上。相同來源的細胞可由1μ mol/L.的維生素A誘導分化成NSE陽性的神經元和GFAP陽性的神經膠質細胞。2.ARC中毒及CP干預模型的建立與對照組比較：ACR組(篩選濃度760 μ mol/L).CP組(篩選濃度4 μmol/ L)、ACR+CP組(ACR 760μ mol/L+CP 4μ mol/L)OD值均低于對照組,其中ACR組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與ACR組比較：各組0D值均高于ACR組,其中與ACR+CP組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)3.細胞內Ca2+濃度的測定與對照組比較：ACR組、ACR+CP組細胞內Ca2+濃度分別升高了47.5%、12.4%(P0.05)。CP組細胞內Ca2+濃度降低了2.7%(P0.05)。與ACR組比較：ACR+CP組細胞內Ca2+濃度降低了23.8%(P0.05)。4.Calpain活性的測定與對照組比較：ACR組Calpain活性升高了23.6%(P0.05),CP組、ACR+CP組Calpain活性分別降低了2.8%、4.1%(PO.05)。與ACR組比較：ACR+CP組Calpain活性降低了22.4%(P0.05)。5.NFs含量的測定與對照組比較,CP組、ACR組、ACR+CP組NF-L, NF-M, NF-H含量均升高。ACR 組 NF-L, NF-M, NF-H分別升高了60.92％、48.31％,35.84％(P0.05)。ACR+CP組NF-L升高了19.87％(P0.05), NF-M, NF-H分別升高了6.01%,10.21%(P0.05)。與ACR組比較,ACR+CP組NF-L, NF-M,NF-H分別降低了25.51%、28.52%,18.87%(P0.05)。結論1.成功建立了以NSCs為受試對象的ACR中毒及CP干預模型。2.CP可有效干預ACR引起的NSCs存活率、Ca卦濃度、Calpain活性、NFs含量的變化。3.ACR引起NFs變化與Calpain活性改變有關,CP通過抑制Calpain活性對ACR引起的NFs損傷產生保護作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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