本文關(guān)鍵詞：硒對雄鼠睪丸硒蛋白組表達(dá)及相關(guān)生殖功能的影響

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【摘要】：研究背景及目的 男性不育是全球性的社會與健康問題，其病因復(fù)雜，但已明確硒（Selenium，Se）缺乏和過量導(dǎo)致的精子發(fā)生過程障礙是其病因之一。硒是機(jī)體必需的微量元素，在體內(nèi)主要通過硒蛋白（Selenoproteins）的形式發(fā)揮生物學(xué)作用。目前關(guān)于機(jī)體硒缺乏或過量導(dǎo)致生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷和功能下降已有不少報道，但是其具體機(jī)制尚未闡明，特別是研究機(jī)體硒水平對雄性生殖系統(tǒng)硒蛋白組表達(dá)的調(diào)控，篩選特異性功能硒蛋白，進(jìn)而探究硒對雄性生殖健康的影響尚未見報道。 研究表明，精液硒水平在男性不育癥患者中普遍偏低，而精液中硒水平在適宜濃度范圍內(nèi)越高，則精子數(shù)量越多，活力越強(qiáng)。人類精子細(xì)胞中含有大量的不飽和脂肪酸，易受精液中存在的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）攻擊，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生丙二醛（Malonaldehyd，MDA）等物質(zhì)，從而損傷精子膜，導(dǎo)致精子活力下降，甚至功能喪失，造成不育。以谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，Gpxs）為代表的硒蛋白具有抗氧化作用，可清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基，推測其可通過抑制脂質(zhì)過氧化作用，對保護(hù)精子免受氧化損傷，提高精子活力發(fā)揮重要作用。 迄今發(fā)現(xiàn)的人類硒蛋白有25種，鼠類硒蛋白有24種，大部分功能已知的有：含硒谷胱甘肽過氧化物酶族（Gpxs，5種）、脫碘酶族（Iodothyronine deiodinases，Dios，3種）、硫氧還蛋白還原酶族（Thioredoxin reductases，Txrnds，3種）、磷酸硒合成酶2（Sps2）、硒蛋白P（Sepp1）；功能僅有少量報道且未被完全證實(shí)的有：硒蛋白15-kDa（Sep15）、硒蛋白H（Selh）、I（Seli）、M（Selm）、N（Sepn1）、R（Selr）、S（Sels）、T（Selt）、W（Sepw1）；而硒蛋白K（Selk）、O（Selo）、V（Selv）等的功能則未知。目前普遍認(rèn)為，具有氧化還原酶活性的硒蛋白是微量元素Se多種生物學(xué)功能的重要執(zhí)行者，它們主要通過自身酶活性，在增強(qiáng)免疫力、抗衰老、預(yù)防心血管疾病和癌癥、維持男性生殖功能等生命活動中發(fā)揮著重要甚至關(guān)鍵性的作用。 睪丸釋放雄性激素（主要是睪酮）并形成生殖細(xì)胞，在組織學(xué)上包括生精小管（曲精小管）和睪丸間質(zhì)，前者主要由生精細(xì)胞和支持細(xì)胞構(gòu)成。生精細(xì)胞是精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子的總稱，這些細(xì)胞依次從基膜向管腔方向移行、成熟并進(jìn)入管腔的過程稱為精子發(fā)生。睪丸是Se明確的重要靶組織之一，如磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx4）等硒蛋白對精子發(fā)生至關(guān)重要，它在精子發(fā)生初期發(fā)揮抗氧化酶的作用，而在成熟精子中則轉(zhuǎn)變?yōu)槭ッ富钚缘谋匦杞Y(jié)構(gòu)蛋白成分；Sepp1則是通過睪丸組織上皮的ApoER2受體，為睪丸提供大部分生理所需的Se；此外也有研究提示Seps1、Sep15、Txnrd3等硒蛋白在維持雄性生殖功能方面發(fā)揮重要作用。2010年，英國科學(xué)家發(fā)表的一篇論文顯示：特異性分布于睪丸組織的Selv（，人類基因符號SELV，鼠類基因符號Selv）主要分布在精子發(fā)生晚期的中、晚期生精細(xì)胞，提示該蛋白在精子發(fā)生過程具有某種重要功能，但目前對其功能的認(rèn)識仍屬空白。 如前所述，Se是硒蛋白的結(jié)構(gòu)成分，但缺Se時，并非所有組織、所有硒蛋白的表達(dá)都會受到影響。一些硒蛋白的mRNA在缺Se時表現(xiàn)出無義介導(dǎo)的降解（Nonsense-mediated decay，NMD）而致硒蛋白表達(dá)水平顯著降低，但另有3條保持特定硒蛋白免受缺Se影響的等級法則：（1）腦與內(nèi)分泌組織硒蛋白表達(dá)優(yōu)先； （2）重要功能硒蛋白表達(dá)優(yōu)先；（3）生殖性別差異硒蛋白表達(dá)優(yōu)先。這些硒蛋白表達(dá)調(diào)控法則隱藏的機(jī)制是分子生物學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。睪丸Gpx4是同時滿足上述3條等級法則的經(jīng)典，膳食Se波動幾乎不能影響其表達(dá)。部分原因可能是血睪屏障內(nèi)具有攜帶Se功能的Sepp1能緩沖Se濃度波動，也可能是睪丸細(xì)胞中Gpx4等本身具有抵制Se水平影響的特殊機(jī)制。對睪丸生精細(xì)胞中特有的Selv，它的作用還有待揭示，而且，活體睪丸組織是否確實(shí)具有保持Selv表達(dá)免受外界Se水平波動影響的特殊能力，這也需要從mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)表達(dá)水平加以證實(shí)。 當(dāng)前，應(yīng)用硒制劑防治硒缺乏病已經(jīng)取得顯著效果，但在治療硒缺乏病時，由于盲目加大硒制劑的用藥劑量，導(dǎo)致硒中毒時有發(fā)生。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)，分析雄性大鼠在不同硒營養(yǎng)水平下，睪丸組織硒蛋白組的表達(dá)特征及其潛在功能，探索Se及硒蛋白在精子發(fā)生和雄性生殖健康中的作用，為防治Se及硒蛋白相關(guān)的男性不育疾病提供理論基礎(chǔ)。 方法 1.實(shí)驗(yàn)方法 1.1實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 將30只4周齡雄性大鼠，以缺硒飼料飼喂5周，建立動物缺硒模型。隨后按體重隨機(jī)分為5組，每組6只大鼠，分別為：缺硒模型組（BD5w組）、缺硒對照組（BD9w組）、適硒組（BD+0.25ppm Se組，記為BD+0.25組），高硒組（BD+3.0ppm Se組，記為BD+3.0組），中毒硒組（BD+5.0ppm Se組，記為BD+5.0組）。BD5w組在9周齡時處死取樣，余下4組以相應(yīng)硒水平繼續(xù)飼養(yǎng)4周。 1.2動物生長性能指標(biāo)測定 每周監(jiān)測動物體重；動物取樣時，稱量睪丸重量，并計(jì)算睪丸指數(shù)。 1.3大鼠組織、血細(xì)胞硒含量測定 采集心臟抗凝全血，離心得血細(xì)胞；分離睪丸、肝臟、腎臟等組織。所有樣品經(jīng)消化處理后，以電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定硒濃度。 1.4大鼠血漿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的測定 按照試劑盒說明，測定大鼠血漿8-OHdG水平。 1.5大鼠精子質(zhì)量和電鏡觀察 缺硒對照組、BD+0.25組、BD+3.0組、BD+5.0組等4組大鼠處死后，分離附睪尾，以精子獲能液搜集各大鼠精子，顯微鏡下觀察（×400）精子密度和精子活力，并錄下視頻；吸取1滴12%中性甲醛固定的精子懸液于載玻片上制備標(biāo)本觀察精子形態(tài)（×400）；離心精子懸液，得精子沉淀物，以2.5%戊二醛固定，常規(guī)電鏡制片，透射電鏡下觀察精子超微結(jié)構(gòu)。 1.6大鼠睪丸硒蛋白組基因的表達(dá)豐度測定（RT-qPCR） 微量勻漿器研磨小塊睪丸組織后，加入RNAiso Plus試劑提取睪丸組織總RNA，制備cDNA第一鏈，以cDNA作模板，qPCR法檢測睪丸硒蛋白基因組表達(dá)水平。 2.統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(One WayAnova)，進(jìn)一步作組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.硒對大鼠睪丸發(fā)育的影響 1.1硒對大鼠體重和睪丸指數(shù)的影響 大鼠飼喂缺硒和過量硒（3.0和5.0ppm Se）飼料可致大鼠生長緩慢，體重下降，體重增長速度由大到小為：BD+0.25組BD+3.0組BD+5.0組缺硒對照組；BD+5.0組的睪丸重和指數(shù)均稍高于其余3個染硒組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），缺硒對照組、BD+0.25組、BD+3.0組3組睪丸重和指數(shù)沒有顯著差異（P0.05）。 1.2硒對大鼠組織硒含量的影響 大鼠缺硒可致睪丸、肝、腎、血細(xì)胞硒濃度明顯降低，缺硒5、9周均低于適硒組（P0.05）；缺硒狀態(tài)下，睪丸硒濃度明顯高于肝、腎、血細(xì)胞（P0.05）；補(bǔ)充不同硒水平飼料后組織硒含量有所升高，其中肝、腎、血細(xì)胞中硒的蓄積濃度與染硒劑量呈明顯正相關(guān)，隨著染硒劑量的增加而迅速升高，而睪丸硒濃度隨著染硒劑量的增加升幅較小，在3.0ppm Se以上染硒劑量時，睪丸硒濃度增速趨于平緩。 1.3硒對大鼠血漿8-OhdG水平的影響 各染硒組8-OHdG水平表現(xiàn)為：缺硒對照組BD+5.0組BD+3.0組BD+0.25組，其中缺硒對照組與BD+0.25組、BD+3.0組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），BD+0.25組、BD+3.0組、BD+5.0組3組間差異不顯著（P0.05）。 2.硒對大鼠精子質(zhì)量和超微結(jié)構(gòu)的影響 2.1精子質(zhì)量 精子密度：各硒干預(yù)組由高至低依次為：BD+0.25組BD+3.0組BD+5.0組缺硒對照組，其中BD+0.25組是缺硒對照組的1.75倍（P0.05），BD+3.0組是缺硒對照組的1.57倍（P0.05）。 精子活力：前向運(yùn)動精子活力方面，BD+0.25組明顯高于缺硒對照組（P0.05），BD+3.0組、BD+5.0組亦高于缺硒對照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；非前向運(yùn)動精子活力方面，缺硒對照組明顯高于BD+0.25組、BD+3.0組、BD+5.0組（P0.05）；精子總活力方面，未發(fā)現(xiàn)缺硒對照組和3個補(bǔ)硒組間有顯著差異（P0.05）。 精子形態(tài)：BD+5.0組精子畸形率最高，缺硒對照組其次，BD+0.25組和BD+3.0組結(jié)果相近。BD+5.0組和BD+0.25組、BD+3.0組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），，與缺硒對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2.2精子超微結(jié)構(gòu) 缺硒對照組（BD9w組）大鼠精核膜出現(xiàn)核周隙，頂體未見，精子中段細(xì)胞膜褶皺；線粒體部分區(qū)域排列紊亂，出現(xiàn)空隙，部分線粒體有明顯空變。適硒組（BD+0.25組），精子頭部精核膜完整，尾段胞膜完整光滑，線粒體呈同心圓排列，結(jié)構(gòu)致密，大部分形態(tài)、大小正常，線粒體空變數(shù)量有所減少；軸絲和外周致密纖維規(guī)律排列整齊。高硒組（BD+3.0組），精子頭部精核膜完整，頂體不明顯，精子中段多見巨大線粒體，部分線粒體空變，最外層胞膜消失；精子尾段外圍出現(xiàn)線粒體部分松解，界限不清。硒中毒組（BD+5.0組），精子頭部細(xì)胞膜出現(xiàn)皺褶，頂體不明顯，外周9條致密纖維部分缺失，精子中段細(xì)胞膜不清晰，線粒體大部分空變；精子尾段纖維鞘部分松散，線粒體丟失，細(xì)胞膜不清晰�？傮w來看，硒中毒組和缺硒對照組精子超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，高硒組次之。而適硒組雖然一定程度上恢復(fù)了缺硒所致的精子超微結(jié)構(gòu)損傷，但仍存留有部分損傷不可恢復(fù)。 3.硒對大鼠睪丸硒蛋白組基因表達(dá)的影響 本試驗(yàn)采用RT-qPCR方法對大鼠睪丸組織硒蛋白組基因進(jìn)行定量檢測。研究結(jié)果顯示，缺硒可致硒蛋白基因表達(dá)普遍下調(diào)，給予大鼠補(bǔ)充不同劑量的硒飼料后，共發(fā)現(xiàn)10個基因mRNA表達(dá)豐度上調(diào)，并且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，在BD+0.25組達(dá)到最高表達(dá)的基因有6個（Gpx1、SnGpx4、Txnrd2、Dio1、Seli、Sepn1），BD+3.0組3個（Selr、Sepp1、Sepw1），BD+5.0組1個（Txnrd1），組間表達(dá)差異達(dá)到2倍以上并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因有6個（Gpx1、SnGpx4、Txnrd1、Txnrd2、Seli、Selr），Txnrd1、SnGpx4、Selr是對硒調(diào)控最敏感的硒蛋白基因。 結(jié)論 1.硒缺乏和過量（3.0和5.0ppm Se）可致大鼠發(fā)育減緩，DNA氧化損傷，精子生成障礙，精子結(jié)構(gòu)損傷、前向運(yùn)動活力下降、畸形率升高，并且下調(diào)多個睪丸硒蛋白基因的表達(dá)； 2.補(bǔ)充0.25ppm Se飼料可改善大鼠發(fā)育狀況，降低DNA氧化損傷程度，有效恢復(fù)精子結(jié)構(gòu)損傷，提升精子質(zhì)量，以及上調(diào)睪丸硒蛋白組基因表達(dá)； 3.大鼠在硒缺乏和過量狀態(tài)下，睪丸硒蛋白表達(dá)異�？芍戮淤|(zhì)量下降，結(jié)構(gòu)破壞。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王海宏,謝忠枕;硒的生物學(xué)功能及其機(jī)理研究[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2003年03期

2 鄭良焰;張琴;劉碧濤;郭凱;余文蘭;劉正偉;陳葉;郭翠麗;唐兆新;;不同硒濃度日糧對小鼠肝臟和睪丸組織中部分硒蛋白mRNA水平的影響[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年03期

3 周繼昌;雷新根;;硒、硒蛋白及其與糖尿病、血脂異常的最新進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年08期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 任香梅;硒對鎘致雄性小鼠生殖毒性的保護(hù)作用及其機(jī)理的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：1174519