本文關(guān)鍵詞：SynapsinI在丙烯酰胺致突觸可塑性損傷中的作用及BDNF干預(yù)的實驗研究

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【摘要】：目的通過探討丙烯酰胺(acrylamide,ACR)對突觸素?(Synapsin?)蛋白表達的影響、對N-甲基馬來酰亞胺敏感因子(NSF)附著蛋白受體(SNARE)復(fù)合體結(jié)合/解離的影響和對Synapsin?上游磷酸化激酶的影響,明確ACR致神經(jīng)元突觸損傷對Synapsin?上下游蛋白調(diào)控的作用機制;通過對突觸損傷的神經(jīng)元進行腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的干預(yù),進一步闡明BDNF對神經(jīng)元突觸損傷的保護作用。方法1將NB-1細(xì)胞通過二丁酰環(huán)腺苷酸(db-c AMP)誘導(dǎo)為成熟神經(jīng)元細(xì)胞后,MTT檢測ACR不同染毒濃度(0、25、50、100、150、200和250μg/ml)在不同染毒時間(24、48和72h)對NB-1細(xì)胞相對存活率的影響;免疫印記(western blot)技術(shù)檢測Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表達,免疫共沉淀(Co-IP)試驗檢測神經(jīng)元突觸損傷前后SNARE復(fù)合體的結(jié)合/解離的變化,并使用Spearman對其進行相關(guān)性分析;使用光鏡和電鏡分別檢測神經(jīng)元突觸損傷前后細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化;通過western blot技術(shù)分別檢測ACR染毒前后絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、環(huán)磷酸腺苷(PKA)和Ⅱ型鈣離子/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(Ⅱ型Ca2+/Ca M激酶)蛋白表達變化。2將誘導(dǎo)為成熟神經(jīng)元的NB-1細(xì)胞經(jīng)60μg/ml ACR染毒后給予不同濃度BDNF(50、75、100和125ng/ml)干預(yù)后通過MTT檢測細(xì)胞相對存活率;使用熒光定量PCR技術(shù)檢測BDNF給予干預(yù)前后Synapsin I m RNA表達的變化,Co-IP試驗檢測BDNF給予干預(yù)前后SNARE復(fù)合體結(jié)合/解離的變化。結(jié)果1 0、25、50和100μg/ml的ACR染毒劑量染毒NB-1細(xì)胞48h后,隨著ACR染毒劑量的增加Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表達降低(P0.05);隨著ACR染毒劑量的增加,SNARE復(fù)合體中突觸融合蛋白(syntaxin)和突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP-25)逐漸解離;ACR染毒損傷NB-1細(xì)胞后,SNARE復(fù)合體中syntaxin和SNAP-25結(jié)合狀態(tài)與Synapsin I、磷酸化Synapsin I(P-Synapsin I)蛋白表達呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r分別為0.897和0.935),與P-Synapsin I/Synapsin I差異性表達呈負(fù)相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r為-0.250);從電鏡圖可知,25μg/ml ACR染毒濃度下觀察到清亮球形突觸小泡和含有高電子密度的致密顆粒的突觸小泡;50μg/ml ACR染毒濃度下觀察到含有高電子密度的致密顆粒的突觸小泡;ACR對NB-1細(xì)胞染毒48h后,在100μg/ml ACR染毒濃度下MAPK蛋白表達降低(P0.05),在25μg/ml ACR染毒濃度下PKA蛋白表達降低(P0.05),隨著ACR染毒劑量的增加,Ⅱ型Ca2+/Ca M依賴蛋白激酶表達增加(P0.05)。2熒光定量PCR試驗結(jié)果表明75ng/ml BDNF+60μg/ml ACR試驗組與60μg/ml ACR試驗組相比,Synapsin I m RNA表達升高(P0.05);Co-IP試驗結(jié)果表明BDNF干預(yù)前后SNARE復(fù)合體中兩個單體syntaxin和SNAP-25結(jié)合/解離狀態(tài)未發(fā)生變化。結(jié)論1突觸內(nèi)特異性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和釋放可能與P-Synapsin I/Synapsin I差異性表達所調(diào)控的SNARE復(fù)合體的解離狀態(tài)導(dǎo)致的突觸功能損傷相關(guān);ACR導(dǎo)致NB-1細(xì)胞神經(jīng)元突觸損傷后,Synapsin I上游磷酸激酶MAPK、PKA和Ⅱ型Ca2+/Ca M依賴蛋白激酶的表達受到影響。2 BDNF對神經(jīng)元突觸損傷具有一定的干預(yù)作用,但在本實驗系統(tǒng)條件下結(jié)果表明BDNF的干預(yù)作用未能調(diào)控SNARE復(fù)合體解離狀態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1158942