本文關(guān)鍵詞：四氯苯醌誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的炎性有關(guān)信號(hào)通路分析

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【摘要】：五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有機(jī)污染物,具有致畸、致癌、致突變性質(zhì),嚴(yán)重地威脅著人類身體健康。盡管二者在環(huán)境中化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定,但仍然可以降解生成其他代謝產(chǎn)物。六氯苯可以通過細(xì)胞色素P450途徑代謝生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氫醌(TCHQ),五氯酚則可以通過鞘氨醇桿菌代謝為四氯苯醌,然后進(jìn)一步還原成四氯氫醌。在這些代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量ROS,破壞生物體內(nèi)的氧化還原平衡,導(dǎo)致毒性效應(yīng)的發(fā)生,如遺傳毒性、肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性等。隨著人口老齡化現(xiàn)象地加重,許多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐漸增高。引起這些疾病的因素很多,包括環(huán)境、基因及老齡化等相關(guān)內(nèi)源性因素,但基本可以概括為由于氧化應(yīng)激的產(chǎn)生導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥形成。近幾年來,關(guān)于六氯苯和五氯酚的神經(jīng)毒性研究已經(jīng)很多,但是關(guān)于四氯苯醌的神經(jīng)毒性,特別是炎癥病理機(jī)制的研究資料卻很少見。探討四氯苯醌誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制,可以為有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供新思路。因此,本文選用PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象,設(shè)想它引起的炎癥毒性與ROS的產(chǎn)生有關(guān),做了以下兩部分實(shí)驗(yàn)。(一)四氯苯醌激活I(lǐng)KK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究本實(shí)驗(yàn)旨在比較六氯苯、五氯酚、四氯氫醌和四氯苯醌四種化合物對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性、ROS產(chǎn)量、促炎癥因子表達(dá)的作用,然后進(jìn)一步探討四氯苯醌激活NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制。首先利用CCK-8實(shí)驗(yàn),比較了四種化合物在不同濃度、不同時(shí)間條件下的細(xì)胞毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種化合物的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性增加,并且與ROS的形成密切相關(guān),其中TCBQ和TCHQ毒性強(qiáng)于pcp、hcb。從dcfh-da探針檢測ros水平及免疫印跡檢測促炎癥因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)tcbq和tchq對(duì)ros和促炎癥因子的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于hcb和pcp。接著用免疫印跡和rt-qpcr實(shí)驗(yàn)手段從濃度梯度上考察了四氯苯醌誘導(dǎo)ikk/iκb/nf-κb信號(hào)通路相關(guān)炎癥蛋白的表達(dá)情況及促炎癥因子的mrna水平,及采用nf-κb特異性抑制劑pdtc考察了tcbq誘導(dǎo)nf-κb核轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示tcbq可以誘導(dǎo)nf-κb信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá),還可以提高促炎癥因子的mrna水平,pdtc則明顯抑制tcbq誘導(dǎo)的nf-κb核轉(zhuǎn)錄及其與目的基因結(jié)合的活性�？寡趸瘎﹏ac、維生素e和姜黃素可以清除tcbq作用細(xì)胞產(chǎn)生的ros,還可以部分抑制ikk/iκb/nf-κb信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá),這說明ros在ikk/iκb/nf-κb信號(hào)通路的活化中扮演著重要角色。(二)褪黑素拮抗四氯苯醌激活hmgb1/tlr4/myd88信號(hào)通路的機(jī)制研究四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí);關(guān)于hmgb1/tlr4/myd88在炎癥研究中的重要性,很多文獻(xiàn)都有介紹;褪黑素是松果體分泌的一種激素,為強(qiáng)大的內(nèi)源性抗氧化劑,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用�；谝陨先c(diǎn),本實(shí)驗(yàn)把tcbq、褪黑素、hmgb1/tlr4/myd88三者聯(lián)系起來,對(duì)它們的相互作用機(jī)制進(jìn)行了探討。首先利用cck-8實(shí)驗(yàn)篩選了褪黑素減緩tcbq細(xì)胞毒性的最適給藥濃度,最終我們選用200μm褪黑素預(yù)處理細(xì)胞1h,再給予25μmtcbq培養(yǎng)細(xì)胞6h進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)研究。用免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀及rt-qpcr實(shí)驗(yàn)考察了tcbq對(duì)tlr4、md2、cd14、myd88的影響,還考察了褪黑素在這個(gè)過程中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)tcbq可以誘導(dǎo)tlr4、md2、cd14、myd88的蛋白表達(dá),tlr4和myd88的mrna水平上升,及促進(jìn)tlr4與其適配器md2、cd14、myd88的結(jié)合,然而褪黑素抑制了tlr4和其適配器的表達(dá),還抑制了它們的相互結(jié)合作用。接著也考察了褪黑素對(duì)tcbq誘導(dǎo)的mapks活性的影響,及對(duì)下游炎癥因子的表達(dá)情況,結(jié)果顯示褪黑素可以逆轉(zhuǎn)tcbq對(duì)mapks活性的誘導(dǎo)作用。用tlr4sirna、myd88sirna轉(zhuǎn)染pc12細(xì)胞觀察蛋白表達(dá)情況,用tlr4敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)觀察小鼠腦部切片的he染色、免疫組化和免疫熒光圖,發(fā)現(xiàn)tcbq在tlr4和myd88基因缺陷的情況下,炎癥損傷明顯降低,這強(qiáng)調(diào)了tlr4信號(hào)途徑在tcbq誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的重要作用。接著我們探討了tcbq是如何激活tlr4信號(hào)通路的。通過免疫熒光、免疫印跡及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),證明tcbq可以使hmgb1在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生乙�；土姿峄揎�,隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),釋放到培養(yǎng)基里。用免疫印跡、免疫熒光、rt-qpcr和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)考察了tcbq在hmgb1和其受體中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)tcbq可以誘導(dǎo)HMGB1及其受體(TLR2、TLR4、TLR9、RAGE)的表達(dá),及促進(jìn)HMGB1與其受體的結(jié)合,在這些受體中,HMGB1與TLR4的作用最強(qiáng)。接著通過蔗糖密度梯度分離實(shí)驗(yàn),將裂解液分成12個(gè)片段,再利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCBQ、HMGB1和LPS可以誘導(dǎo)TLR4/MD2向脂筏區(qū)域募集,褪黑素作為抗氧化劑跟NAC、脂筏抑制劑(β-環(huán)糊精和制霉菌素)顯示相同的結(jié)果,這說明了ROS參與了TCBQ誘導(dǎo)TLR4向脂筏轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。用HMGB1 si RNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,觀察相關(guān)蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)褪黑素可以抑制HMGB1調(diào)控TCBQ誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)途徑。用TLR4基因敲除的小鼠,觀察到TLR4基因缺陷可以保護(hù)TCBQ引起的小鼠腦損傷,同時(shí)還可以部分抑制HMGB1出核及釋放。綜合以上兩部分實(shí)驗(yàn),可得知四氯苯醌誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng),主要是通過活性氧激活I(lǐng)KK/IκB/NF-κB信號(hào)通路和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)HMGB1釋放,隨后招募TLR4向脂筏區(qū)域轉(zhuǎn)錄。
【關(guān)鍵詞】：四氯苯醌 ROS 神經(jīng)炎癥 IKK/IκB/NF-κB HMGB1/TLR4/MyD88
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 縮寫符號(hào)對(duì)照表14-15
• 第一章 緒論15-23
• 1.1 持久性有機(jī)污染物15-16
• 1.1.1 持久性有機(jī)污染物的特性15
• 1.1.2 持久性有機(jī)污染物的種類15
• 1.1.3 持久性有機(jī)污染物的危害15-16
• 1.1.4 持久性有機(jī)污染物的國內(nèi)外現(xiàn)狀分析16
• 1.2 六氯苯16-17
• 1.3 五氯酚17
• 1.4 四氯苯醌17-18
• 1.5 褪黑素18-19
• 1.6 NF-κB信號(hào)通路19
• 1.7 HMGB1/TLR4/MyD88信號(hào)通路19-21
• 1.7.1 HMGB1的結(jié)構(gòu)特征19-20
• 1.7.2 HMGB1的分泌和釋放20
• 1.7.3 HMGB1的受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)20-21
• 1.8 課題意義和依據(jù)21-23
• 第二章 四氯苯醌激活I(lǐng)KK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究23-41
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.2.3 常用試劑制備方法25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-33
• 2.3.1 細(xì)胞前處理26
• 2.3.2 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)26
• 2.3.3 細(xì)胞蛋白的提取26-27
• 2.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測27
• 2.3.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)27-28
• 2.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)28-29
• 2.3.7 PGE2酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.3.8 細(xì)胞內(nèi)NO含量檢測30
• 2.3.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.3.10 電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.3.11 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)32-33
• 2.3.12 數(shù)據(jù)分析33
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 2.4.1 四種化合物的細(xì)胞毒性、ROS水平和促炎癥因子蛋白表達(dá)情況33-34
• 2.4.2 TCBQ對(duì)PC12細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路活化的影響34-35
• 2.4.3 TCBQ對(duì)PC12細(xì)胞促炎癥因子蛋白和mRNA水平的影響35-36
• 2.4.4 PDTC對(duì)TCBQ誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化的影響36-37
• 2.4.5 抗氧化劑對(duì)TCBQ誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化的影響37-38
• 2.5 討論38-41
• 第三章 褪黑素拮抗TCBQ激活HMGB1/TLR4/MyD88信號(hào)通路的機(jī)制研究41-65
• 3.1 引言41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑41-42
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象42
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-49
• 3.3.1 細(xì)胞前處理42
• 3.3.2 動(dòng)物模型建立42-43
• 3.3.3 組織病理學(xué)檢查43
• 3.3.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)43-44
• 3.3.5 組織免疫熒光44
• 3.3.6 蛋白提取44-45
• 3.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)45-46
• 3.3.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)46
• 3.3.9 電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)實(shí)驗(yàn)46
• 3.3.10 免疫共沉淀(Co-IP)46-47
• 3.3.11 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)47-48
• 3.3.12 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞48
• 3.3.13 蔗糖密度梯度離心法分離脂筏48-49
• 3.3.14 數(shù)據(jù)分析49
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-60
• 3.4.1 褪黑素抑制TCBQ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率下降49-50
• 3.4.2 褪黑素制TCBQ誘導(dǎo)TLR4和其適配器蛋白的表達(dá)及結(jié)合50-51
• 3.4.3 褪黑素抑制TCBQ誘導(dǎo)MAPKs活性51-52
• 3.4.4 褪黑素抑制TCBQ誘導(dǎo)促炎癥因子蛋白和mRNA表達(dá)52-53
• 3.4.5 TLR4、MyD88 si RNA保護(hù)PC12細(xì)胞免受TCBQ誘導(dǎo)的炎癥損傷53
• 3.4.6 TLR4基因缺陷保護(hù)小鼠免受TCBQ誘導(dǎo)的腦損傷53-54
• 3.4.7 褪黑素阻斷TCBQ誘導(dǎo)HMGB1核質(zhì)轉(zhuǎn)錄和釋放54-55
• 3.4.8 TCBQ誘導(dǎo)HMGB1相關(guān)受體的表達(dá)及HMGB1與其受體的結(jié)合55-56
• 3.4.9 褪黑素抑制TCBQ誘導(dǎo)TLR4向脂筏區(qū)域募集56-57
• 3.4.10 HMGB1 siRNA抑制TCBQ誘導(dǎo)的炎癥因子蛋白表達(dá)57-58
• 3.4.11 TCBQ誘導(dǎo)小鼠炎癥因子表達(dá)及HMGB1的釋放部分依賴TLR458-60
• 3.5 討論60-65
• 全文總結(jié)65-67
• 參考文獻(xiàn)67-77
• 致謝77-79
• 發(fā)表論文79

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本文編號(hào)：1112703