本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)HEK 293T細胞自噬與凋亡關(guān)系的初步研究

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【摘要】：本實驗室的研究已經(jīng)證明低濃度的鎘(10 μM)可以誘導(dǎo)細胞自噬,而在高濃度鎘刺激下細胞會發(fā)生凋亡。本實驗采用細胞培養(yǎng)、透射電子顯微鏡、Western blot,倒置相差顯微鏡、激光共聚焦、流式細胞術(shù)等細胞生物學(xué)技術(shù),以HEK 293T細胞為研究對象,研究分析了白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的HEK 293T細胞自噬之間的關(guān)系；以鎘誘導(dǎo)的自噬為前提,探究白藜蘆醇與自噬體-溶酶體融合之間的關(guān)系；分析了白藜蘆醇(RSV)的抗氧化性與鎘誘導(dǎo)的自噬間的關(guān)系；探究白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡之間的關(guān)系。具體實驗結(jié)果如下：1、白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的HEK 293T細胞自噬的關(guān)系HEK 293T細胞懸液(5×105)接種于6孔培養(yǎng)板中,隨機分成對照組和試驗組。試驗組：①細胞暴露于40μM中24 h；②細胞用白藜蘆醇(40 μM)預(yù)處理1小時后暴露于(0-10μM)鎘中24 h；③選用40 μM白藜蘆醇和5 mM 3-MA聯(lián)合8和10μ鎘處理HEK 293T細胞24 h。本試驗采用透射電子顯微鏡觀察自噬體與自噬溶酶體；Western blotting分析自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達量的變化；激光共聚焦顯微鏡分析GFP-LC3的點狀聚集。結(jié)果顯示,HEK 293T細胞暴露在鎘后,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)自噬體數(shù)目明顯增多。白藜蘆醇能加強鎘誘導(dǎo)的自噬,且在8和10μM時變化明顯,加入自噬抑制劑3-MA后這種現(xiàn)象被抑制。提示：鎘能誘導(dǎo)自噬,而白藜蘆醇能夠協(xié)同鎘引起細胞自噬。2、白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)細胞自噬中自噬體-溶酶體融合的關(guān)系HEK 293T細胞懸液(5×105)接種于6孔板中,選用40 μM RSV和/或5mM3-MA分別聯(lián)合8和10μM Cd處理KEK 293T細胞24 h；選用40 μM RSV和/或3μM TG分別聯(lián)合8和10 μMCd處理KEK 293T細胞24 h。利用Western blotting分析溶酶體標志蛋白cathepsin L、自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達量；用激光共聚焦觀察GFP-LC3和LAMP2的共定位。結(jié)果顯示,在鎘誘導(dǎo)的細胞自噬中,白藜蘆醇能增強溶酶體的活性,而當自噬被抑制時溶酶體的活性也降低；加入自噬體溶酶體融合抑制劑TG以后,雖然增加了細胞的自噬能力,卻降低了溶酶體的活性,而白藜蘆醇未能改變這種結(jié)果。提示：白藜蘆醇可能起作用的階段是在自噬體溶酶體融合之前3、白藜蘆醇的抗氧化性與鎘介導(dǎo)的細胞自噬之間的關(guān)系HEK 293T細胞懸液(5×105)接種于6孔板中。試驗組：細胞用白藜蘆醇(40州)預(yù)處理1小時后暴露于(0-10μM)鎘中24 h；用40μM RSV和/或1μMEX-527分別聯(lián)合10μM鎘處理KEK 293T細胞24 h；用40μM RSV和/或1μM EX-527分別聯(lián)合1 mM H2O2處理KEK 293T細胞24h。利用酶標儀檢測活性氧ROS的表達量；Western blotting分析SIRT1蛋白、自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達量；用激光共聚焦GFP-LC3和LAMP2的共定位。結(jié)果顯示,隨著鎘濃度的增加ROS也增加,而加入白藜蘆醇后ROS降低；白藜蘆醇能激活SIRT1,而當SIRT1的表達量被抑制時,白藜蘆醇對自噬的促進作用也減弱。提示：白藜蘆醇增強鎘誘導(dǎo)的自噬可能都與其抗氧化性有關(guān),而其中SIRT1起著重要的作用。4、白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡之間的關(guān)系HEK 293T細胞懸液(5×105)接種于6孔板中,適應(yīng)性培養(yǎng)后,用40μMRSV、10μMCd、20μM Cd、10μM Cd+RSV和20 μM Cd+RSV分別處理HEK293T細胞。相應(yīng)時間后用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)；Western blotting分析caspase-3的表達量；用流式細胞儀分析細胞凋亡數(shù)量。結(jié)果顯示,HEK 293T細胞暴露于鎘24 h后,細胞皺縮變形甚至死亡,而加入白藜蘆醇后,細胞形態(tài)改變被抑制；鎘誘導(dǎo)了caspase-3表達量增加,而加入白藜蘆醇后被降低：鎘誘導(dǎo)細胞凋亡可以被白藜蘆醇阻滯。提示：白藜蘆醇能抑制鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡。本研究在低濃度鎘(0～10μM)誘導(dǎo)自噬的基礎(chǔ)上進行。白藜蘆醇能增強鎘誘導(dǎo)的細胞自噬,而其作用階段可能是在自噬體溶酶體融合之前,而且可能與白藜蘆醇的抗氧化性有關(guān),SIRT1可能在其中扮演著重要的角色,白藜蘆醇還能抑制鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：鎘 HEK 293T 白藜蘆醇 自噬 溶酶體活性 自噬體-溶酶體融合 活性氧 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一部分 文獻綜述12-35
• 第一章 鎘的性質(zhì)及毒性作用13-20
• 1.1 鎘的理化性質(zhì)13
• 1.2 鎘的毒性13-15
• 1.2.1 鎘對人體的危害13-14
• 1.2.2 鎘中毒的機理14
• 1.2.3 鎘中毒的干預(yù)措施14-15
• 1.3 鎘與氧化應(yīng)激15-17
• 1.3.1 氧化應(yīng)激15
• 1.3.2 鎘致氧化應(yīng)激15-17
• 參考文獻17-20
• 第二章 自噬(Autophagy)機理的概述20-28
• 2.1 自噬的定義及其發(fā)生過程20-22
• 2.1.1 自噬的定義20-21
• 2.1.2 自噬的分類21
• 2.1.3 自噬的觀察檢測21-22
• 2.2 細胞自噬的分子機制22-23
• 2.3 細胞自噬與細胞凋亡的關(guān)系23
• 2.4 鎘致細胞自噬與凋亡的研究進展23-25
• 參考文獻25-28
• 第三章 白藜蘆醇的性質(zhì)及生物學(xué)功能28-35
• 3.1 白藜蘆醇的來源及理化性質(zhì)28
• 3.2 白藜蘆醇的化學(xué)制備28-29
• 3.3 白藜蘆醇的生物學(xué)功能29-30
• 3.3.1 白藜蘆醇的抗氧化作用29
• 3.3.2 白藜蘆醇的抗癌作用29-30
• 3.3.3 白藜蘆醇對心血管疾病的保護作用30
• 3.4 白藜蘆醇與自噬的關(guān)系30-31
• 3.5 白藜蘆醇與SIRT1的關(guān)系31-32
• 參考文獻32-35
• 第二部分 實驗研究35-68
• 第四章 白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的自噬關(guān)系的初步探究36-45
• 4.1 材料37
• 4.1.1 主要試劑37
• 4.1.2 實驗儀器37
• 4.1.3 細胞系37
• 4.2 方法37-39
• 4.2.1 細胞的培養(yǎng)37-38
• 4.2.2 透射電子顯微鏡觀察細胞自噬體、溶酶體形態(tài)38
• 4.2.3 免疫印記(Western blot)分析38-39
• 4.2.4 激光共聚焦分析39
• 4.2.5 數(shù)據(jù)處理39
• 4.3 結(jié)果與分析39-42
• 4.3.1 透射電子顯微鏡觀察鎘誘導(dǎo)HEK 293T細胞內(nèi)自噬體的形成39-40
• 4.3.2 白藜蘆醇能增強鎘誘導(dǎo)的細胞自噬40-41
• 4.3.3 3-MA抑制鎘誘導(dǎo)的細胞自噬及白藜蘆醇的協(xié)同作用41-42
• 4.4 討論42-44
• 參考文獻44-45
• 第五章 白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)細胞自噬中自噬體-溶酶體融合的關(guān)系45-53
• 5.1 材料46
• 5.1.1 主要試劑46
• 5.1.2 實驗儀器46
• 5.1.3 細胞系46
• 5.2 方法46-48
• 5.2.1 細胞的培養(yǎng)46-47
• 5.2.2 免疫印記(Western blot)分析47
• 5.2.3 激光共聚焦分析47-48
• 5.2.4 數(shù)據(jù)處理48
• 5.3 結(jié)果與分析48-50
• 5.3.1 白藜蘆醇對溶酶體活性的影響48-49
• 5.3.2 白藜蘆醇與自噬體溶酶體融合之間的關(guān)系49-50
• 5.3.3 激光共聚焦觀察RSV/Cd對自噬體溶酶體融的影響50
• 5.4 討論50-52
• 參考文獻52-53
• 第六章 白藜蘆醇的抗氧化性與鎘介導(dǎo)的細胞自噬之間的關(guān)系53-61
• 6.1 材料54
• 6.1.1 主要試劑54
• 6.1.2 實驗儀器54
• 6.1.3 細胞系54
• 6.2 方法54-56
• 6.2.1 細胞的培養(yǎng)54-55
• 6.2.2 活性氧檢測55
• 6.2.3 免疫印記(Western blot)分析55
• 6.2.4 激光共聚焦分析55-56
• 6.2.5 數(shù)據(jù)處理56
• 6.3 結(jié)果與分析56-58
• 6.3.1 白藜蘆醇能降低鎘誘導(dǎo)的活性氧增加56-57
• 6.3.2 白藜蘆醇通過激活SIRT1調(diào)節(jié)鎘誘導(dǎo)的自噬57-58
• 6.3.3 抑制SIRT1可以減少自噬體溶酶體融合58
• 6.4 討論58-60
• 參考文獻60-61
• 第七章 白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡之間的關(guān)系61-68
• 7.1 材料61-62
• 7.1.1 主要試劑61-62
• 7.1.2 實驗儀器62
• 7.1.3 細胞系62
• 7.2 方法62-64
• 7.2.1 細胞的培養(yǎng)62
• 7.2.2 細胞活性形態(tài)學(xué)分析62-63
• 7.2.3 免疫印記(Western blot)分析63
• 7.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡63
• 7.2.5 數(shù)據(jù)處理63-64
• 7.3 結(jié)果與分析64-66
• 7.3.1 相差倒置顯微鏡觀察白藜蘆醇對鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響64-65
• 7.3.2 Western blot檢測白藜蘆醇對鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響65-66
• 7.3.3 流式細胞術(shù)檢測白藜蘆醇對鎘誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響66
• 7.4 討論66-67
• 參考文獻67-68
• 全文總結(jié)68-69
• 英文縮略詞表69-70
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文70-71
• 致謝71

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1 劉小}，

本文編號：1044826