本文關(guān)鍵詞：飲用水中亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合作用與食管癌的關(guān)系研究

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【摘要】：目的：近年來,由于我國廣泛的工業(yè)污染以及農(nóng)藥、化肥的過度使用,造成地面水體中含氮化合物的增加、水體富營養(yǎng)化進而導(dǎo)致藻類的過度繁殖。含較高含量含氮化合物的水源水經(jīng)過集中式供水氯化消毒處理后可產(chǎn)生飲用水中亞硝胺類消毒副產(chǎn)物(nitrosamines,NAms),研究表明,NAms在原水、出廠水、管網(wǎng)末梢水中均可檢出且其濃度逐漸升高。微囊藻毒素(Microcystin)也可在原水中檢出,且自來水廠常規(guī)處理工藝不能使其完全消除,原水處理后仍可檢出。因此,人群可經(jīng)飲水長期持續(xù)暴露于亞硝胺類消毒副產(chǎn)物和微囊藻毒素。在飲用水中亞硝胺類消毒副產(chǎn)物和微囊藻毒素等化學(xué)物的低濃度、長期和聯(lián)合作用下,可能增加常規(guī)處理工藝的集中供水人群的致癌風(fēng)險。本研究以甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒F-344大鼠,探討兩毒物在食管癌癌前病變發(fā)生中的聯(lián)合作用；并進一步應(yīng)用甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒正常食管上皮HET-1A細胞和食管癌EC109細胞,觀察其與食管癌發(fā)生發(fā)展的影響；初步明確甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒使食管上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化參與調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法和結(jié)果：1、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)大鼠癌前病變實驗本研究將雄性F-344大鼠分為對照組、NMBzA單獨染毒組、MC-LR單獨染毒組及聯(lián)合染毒組四組進行染毒處理,每周3次,隔天一次,共5周。染毒結(jié)束后分別在19、22、25和28周依次處死聯(lián)合染毒組大鼠,一次3只,觀測大鼠癌變情況。到31周時處死全部動物。大鼠處死后取食管中段組織以10%福爾馬林固定4h,經(jīng)常規(guī)石蠟包埋HE染色后送病理檢查。結(jié)果顯示：25周后可觀測到大鼠食管發(fā)生增生且隨時間延長增生加重。31周時,空白組和MC-LR單獨染毒組均未觀測到有病變發(fā)生；NMBzA單獨染毒組增生率為60%,其中40%為輕度增生,20%為中度增生；聯(lián)合染毒組增生率為100%,其中25%為輕度增生,62.5%為中度增生,12.5%為重度增生。表明甲基芐基亞硝胺單獨染毒可以誘發(fā)癌前病變,微囊藻毒素單獨染毒不能誘發(fā)癌前病變,但是可以作為促進劑與甲基芐基亞硝胺協(xié)同誘導(dǎo)食管癌癌前病變的發(fā)生。2、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響2.1甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)正常食管上皮HET-1A細胞惡性轉(zhuǎn)化2.1.1甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒的聯(lián)合作用研究(1)收集處于對數(shù)生長期的HET-1A分為四組,陰性對照組、NMBzA (11nmol/L、 10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/L)單獨染毒組、MC-LR (1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L)單獨染毒組及各濃度聯(lián)合染毒組成的聯(lián)合染毒組,染毒24h后采用MTT實驗得到甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨及聯(lián)合染毒24h的細胞抑制率結(jié)果。結(jié)果顯示,NMBzA單獨染毒時,隨濃度增加其抑制率顯著增加(P0.05)；MC-LR單獨染毒時,MC-LR抑制率先降低后增加(P0.05)；NMBzA與MC-LR聯(lián)合染毒組抑制率隨著濃度升高先降低再增加(P0.05)。(2)應(yīng)用析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示,不同染毒劑量NMBzA與MC-LR均對細胞抑制率有影響(P0.05),NMBzA隨染毒劑量增加抑制率也增加；MC-LR與NMBzA兩毒物有交互作用(P0.05),NMBzA 1mmol/L和MC-LR 10μmol/L時抑制率最高。(3)應(yīng)用中效原理判斷兩毒物聯(lián)合作用類型,結(jié)果顯示,當(dāng)fa0.23時,CI1,兩毒物聯(lián)合產(chǎn)生拮抗效應(yīng)；當(dāng)fa0.23時,CI1,兩毒物聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。2.1.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨及聯(lián)合染毒20代對HET-1A細胞克隆形成能力的影響收集染毒20代后的HET-1A細胞計數(shù)后種入六孔板中進行平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗,結(jié)果顯示,NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA與MC-LR均可使細胞克隆形成率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而聯(lián)合染毒組克隆形成率高于NMBzA和MC-LR單獨染毒組,提示NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。2.1.3甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨及聯(lián)合染毒20代對HET-1A細胞生物學(xué)功能的影響收集染毒20代后的HET-1A細胞,分析兩毒物單獨及聯(lián)合染毒細胞周期、凋亡、遷移及侵襲能力的改變。(1)利用流式細胞術(shù)(PI染色)檢測NMBzA與MC-LR單獨及聯(lián)合染毒24h后細胞周期的改變。結(jié)果顯示,NMBzA與MC-LR具有交互作用,NMBzA與MC-LR單獨染毒組及聯(lián)合染毒組均表現(xiàn)為G1期縮短,S期和G2期延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示細胞可能阻滯在S期,DNA合成增加,增殖失控。(2)利用流式細胞術(shù)(Annexin V-FITC標(biāo)記)檢測NMBzA與MC-LR單獨及聯(lián)合染毒24h后細胞凋亡率。結(jié)果顯示,NMBzA單獨染毒組促進細胞凋亡,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NMBzA與MC-LR聯(lián)合染毒對細胞凋亡的影響沒有交互作用。(3)采用Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示,NMBzA 與 MC-LR具有交互作用,MC-LR可促進細胞遷移,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。NMBzA與MC-LR 均可促進細胞侵襲,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,提示NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進細胞侵襲。2.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對食管癌EC109細胞惡性表型的影響根據(jù)HET-1A細胞得到的兩毒物聯(lián)合作用結(jié)果,分別設(shè)立低、中、高三個劑量組單獨及聯(lián)合染毒EC109細胞24h,檢測不同劑量兩毒物單獨及聯(lián)合染毒對EC109細胞周期、凋亡、遷移及侵襲能力的影響。(1)利用流式細胞術(shù)(PI染色)檢測NMBzA與MC-LR單獨及聯(lián)合染毒24h后細胞周期的改變。結(jié)果顯示,與對照組相比,各染毒組細胞G1期縮短,S期延長(P0.05),表明細胞阻滯在S期,出現(xiàn)了一定程度的增殖失控。(2)利用流式細胞術(shù)(Annexin V-FITC標(biāo)記)檢測NMBzA與MC-LR單獨及聯(lián)合染毒24h后細胞凋亡率。低劑量組對細胞凋亡無顯著改變,中劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合抑制細胞凋亡(P0.05),高劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合促進細胞凋亡(P0.05)。(3)使用Transwell小時檢測細胞遷移和侵襲能力,低劑量組細胞遷移和侵襲能力無顯著改變,中、高劑量組MC-LR和NMBzA協(xié)同促進細胞遷移和侵襲(P0.05)。3、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對]HET-1A細胞的惡性轉(zhuǎn)化機制研究3.1不同食管細胞內(nèi)OATP1B1和OATP1B3的表達情況收集己染毒10代和20代的HET-1A細胞,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)測定OATP1B1和OATP1B3在不同食管細胞內(nèi)mRNA表達情況。實驗結(jié)果顯示,有機陰離子轉(zhuǎn)運肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮細胞和食管癌細胞中都有表達,與正常食管上皮細胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌細胞C17、EC109、EC9706內(nèi)表達均增加(P0.05)；OATP1B3在食管癌細胞EC109、EC9706內(nèi)表達均增加(P0.05)。3.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒調(diào)控信號通路節(jié)點基因PP2A和Ras基因的表達采用實時熒光定量PCR技術(shù)對已染毒10代和20代的HET-1A細胞內(nèi)調(diào)控通路節(jié)點基因PP2A和Ras基因的mRNA表達水平進行檢測。(1)對于PP2A基因,染毒10代時尚不能認為NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨染毒促進PP2A表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,染毒20代時NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨染毒促進PP2A表達,MC-LR單獨染毒抑制PP2A表達,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)對于Ras基因,染毒10代時可以認為NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨染毒促進Ras表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,染毒20代時NMBzA與MC-LR也存在交互作用,NMBzA與MC-LR單獨染毒均促進Ras基因表達,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,且聯(lián)合染毒組Ras表達明顯高于兩毒物的表達,提示兩毒物可協(xié)同促進Ras基因的表達。3.3甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒信號通路分析應(yīng)用Western Blotting半定量技術(shù)測定己染毒10代和20代的HET-1A細胞內(nèi)MAPK家族成員ERK、JNK和P38MAPK,MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子ELK1和c-Myc,P53通路中細胞周期相關(guān)蛋白P53、Cdc25C和Cdc2以及細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表達及其磷酸化水平表達。(1)ERK蛋白的磷酸化表達水平在MC-LR單獨染毒組明顯升高,并且隨著MC-LR染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)出依賴性,在NMBzA單獨染毒組和聯(lián)合染毒組先降低后增加,在聯(lián)合染毒組表達最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；JNK蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加而增加,在20代的聯(lián)合染毒組表達最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；P38 MAPK蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加呈降低趨勢；提示NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒可以通過激活ERK和JNK蛋白的磷酸化激活MAPK通路。(2)ELK1蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加先降低后增加,在20代的聯(lián)合染毒組表達最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；c-Myc在MC-LR單獨染毒組和聯(lián)合染毒組磷酸化水平均隨染毒代數(shù)增加而增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明聯(lián)合染毒組確實可以激活MAPK通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子,促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。(3)對于P53基因的mRNA表達,染毒10代時尚不能認為NMBzA與MC-LR存在交互作用,染毒20代時NMBzA與 MC-LR存在交互作用,NMBzA與MC-LR均促進P53表達,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,但聯(lián)合染毒組P53表達明顯降低,提示兩毒物可協(xié)同抑制P53基因的表達,P53 (Ser37)蛋白表達也與mRNA表達結(jié)果一致。Cdc25C蛋白的磷酸化水平在聯(lián)合染毒組中隨染毒代數(shù)增加而增加,在20代的聯(lián)合染毒組中表達最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；磷酸化的Cdc2蛋白(Ser37)表達水平均隨染毒代數(shù)增加而降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒引起細胞阻滯,DNA合成增加,使細胞周期呈現(xiàn)出一定程度的增殖失控。(4)Bcl-2蛋白表達量、Bax蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值均隨染毒代數(shù)增加而增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示細胞凋亡趨勢逐漸減弱,從而促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)論：1.甲基芐基亞硝胺單獨染毒可以誘發(fā)F344大鼠出現(xiàn)癌前病變,微囊藻毒素單獨染毒無法誘發(fā)癌前病變,但可在甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒中發(fā)揮促癌劑作用促進甲基芐基亞硝胺的食管癌癌前病變作用。2.甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合低劑量具有拮抗效應(yīng),高劑量具有協(xié)同效應(yīng)。甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素可協(xié)同促進正常食管上皮細胞HET-1A細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素可協(xié)同將細胞阻滯在S期,使細胞增殖失控；NMBzA促進細胞凋亡；MC-LR可促進細胞遷移；NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進細胞侵襲。3.不同劑量甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素染毒食管癌細胞時,可協(xié)同將細胞阻滯在S期,使細胞增殖失控；中劑量組聯(lián)合抑制細胞凋亡,高劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合促進細胞凋亡；NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進細胞遷移和侵襲。4.有機陰離子轉(zhuǎn)運肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮細胞和食管癌細胞中都有表達,與正常食管上皮細胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌細胞C17、EC109、 EC9706內(nèi)表達均增加；OATP1B3在食管癌細胞EC109、EC9706內(nèi)表達均增加。5.與對照組相比,甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨及聯(lián)合染毒組PP2A表達降低,Ras表達增加。表明NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒可以通過抑制PP2A表達和促進Ras表達激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。6.甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒可以通過激活MAPK通路,促進MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子ELK1和c-Myc的表達；抑制P53的表達,促進Cdc25C蛋白的表達,抑制Cdc2蛋白表達使細胞阻滯,DNA合成增加,細胞增殖失控。Bcl-2蛋白表達量、Bax蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值均隨染毒代數(shù)增加而增加,凋亡趨勢逐漸減弱,從而促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：亞硝胺 微囊藻毒素 食管癌 聯(lián)合作用
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R123
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 縮略詞表17-19
• 前言19-22
• 第一章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)大鼠致癌實驗22-27
• 1 材料和方法22-23
• 2 結(jié)果23-25
• 3 討論25-27
• 第二章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響27-43
• 第一節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)正常食管上皮HET-1A細胞惡性轉(zhuǎn)化27-37
• 第二節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對食管癌EC109細胞惡性表型的影響37-43
• 第三章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒影響食管癌發(fā)病的機制研究43-58
• 第一節(jié) 不同食管細胞內(nèi)OATP1B1和OATP1B3的表達情況43-48
• 第二節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒調(diào)控信號通路節(jié)點基因PP2A和Ras基因的表達48-49
• 第三節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒信號通路分析49-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-63
• 綜述 亞硝胺類消毒融產(chǎn)物和微囊藻毒素與食管癌發(fā)生關(guān)系的研究進展63-74
• 參考文獻70-74
• 作者簡介74-75
• 致謝75

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本文編號：1040755