本文關(guān)鍵詞：飲用水中亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合作用與食管癌的關(guān)系研究

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【摘要】：目的：近年來(lái),由于我國(guó)廣泛的工業(yè)污染以及農(nóng)藥、化肥的過(guò)度使用,造成地面水體中含氮化合物的增加、水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)而導(dǎo)致藻類的過(guò)度繁殖。含較高含量含氮化合物的水源水經(jīng)過(guò)集中式供水氯化消毒處理后可產(chǎn)生飲用水中亞硝胺類消毒副產(chǎn)物(nitrosamines,NAms),研究表明,NAms在原水、出廠水、管網(wǎng)末梢水中均可檢出且其濃度逐漸升高。微囊藻毒素(Microcystin)也可在原水中檢出,且自來(lái)水廠常規(guī)處理工藝不能使其完全消除,原水處理后仍可檢出。因此,人群可經(jīng)飲水長(zhǎng)期持續(xù)暴露于亞硝胺類消毒副產(chǎn)物和微囊藻毒素。在飲用水中亞硝胺類消毒副產(chǎn)物和微囊藻毒素等化學(xué)物的低濃度、長(zhǎng)期和聯(lián)合作用下,可能增加常規(guī)處理工藝的集中供水人群的致癌風(fēng)險(xiǎn)。本研究以甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒F-344大鼠,探討兩毒物在食管癌癌前病變發(fā)生中的聯(lián)合作用；并進(jìn)一步應(yīng)用甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒正常食管上皮HET-1A細(xì)胞和食管癌EC109細(xì)胞,觀察其與食管癌發(fā)生發(fā)展的影響；初步明確甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒使食管上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化參與調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。方法和結(jié)果：1、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)大鼠癌前病變實(shí)驗(yàn)本研究將雄性F-344大鼠分為對(duì)照組、NMBzA單獨(dú)染毒組、MC-LR單獨(dú)染毒組及聯(lián)合染毒組四組進(jìn)行染毒處理,每周3次,隔天一次,共5周。染毒結(jié)束后分別在19、22、25和28周依次處死聯(lián)合染毒組大鼠,一次3只,觀測(cè)大鼠癌變情況。到31周時(shí)處死全部動(dòng)物。大鼠處死后取食管中段組織以10%福爾馬林固定4h,經(jīng)常規(guī)石蠟包埋HE染色后送病理檢查。結(jié)果顯示：25周后可觀測(cè)到大鼠食管發(fā)生增生且隨時(shí)間延長(zhǎng)增生加重。31周時(shí),空白組和MC-LR單獨(dú)染毒組均未觀測(cè)到有病變發(fā)生；NMBzA單獨(dú)染毒組增生率為60%,其中40%為輕度增生,20%為中度增生；聯(lián)合染毒組增生率為100%,其中25%為輕度增生,62.5%為中度增生,12.5%為重度增生。表明甲基芐基亞硝胺單獨(dú)染毒可以誘發(fā)癌前病變,微囊藻毒素單獨(dú)染毒不能誘發(fā)癌前病變,但是可以作為促進(jìn)劑與甲基芐基亞硝胺協(xié)同誘導(dǎo)食管癌癌前病變的發(fā)生。2、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響2.1甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)正常食管上皮HET-1A細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化2.1.1甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒的聯(lián)合作用研究(1)收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HET-1A分為四組,陰性對(duì)照組、NMBzA (11nmol/L、 10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/L)單獨(dú)染毒組、MC-LR (1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L)單獨(dú)染毒組及各濃度聯(lián)合染毒組成的聯(lián)合染毒組,染毒24h后采用MTT實(shí)驗(yàn)得到甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨(dú)及聯(lián)合染毒24h的細(xì)胞抑制率結(jié)果。結(jié)果顯示,NMBzA單獨(dú)染毒時(shí),隨濃度增加其抑制率顯著增加(P0.05)；MC-LR單獨(dú)染毒時(shí),MC-LR抑制率先降低后增加(P0.05)；NMBzA與MC-LR聯(lián)合染毒組抑制率隨著濃度升高先降低再增加(P0.05)。(2)應(yīng)用析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,不同染毒劑量NMBzA與MC-LR均對(duì)細(xì)胞抑制率有影響(P0.05),NMBzA隨染毒劑量增加抑制率也增加；MC-LR與NMBzA兩毒物有交互作用(P0.05),NMBzA 1mmol/L和MC-LR 10μmol/L時(shí)抑制率最高。(3)應(yīng)用中效原理判斷兩毒物聯(lián)合作用類型,結(jié)果顯示,當(dāng)fa0.23時(shí),CI1,兩毒物聯(lián)合產(chǎn)生拮抗效應(yīng)；當(dāng)fa0.23時(shí),CI1,兩毒物聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。2.1.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨(dú)及聯(lián)合染毒20代對(duì)HET-1A細(xì)胞克隆形成能力的影響收集染毒20代后的HET-1A細(xì)胞計(jì)數(shù)后種入六孔板中進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA與MC-LR均可使細(xì)胞克隆形成率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而聯(lián)合染毒組克隆形成率高于NMBzA和MC-LR單獨(dú)染毒組,提示NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。2.1.3甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨(dú)及聯(lián)合染毒20代對(duì)HET-1A細(xì)胞生物學(xué)功能的影響收集染毒20代后的HET-1A細(xì)胞,分析兩毒物單獨(dú)及聯(lián)合染毒細(xì)胞周期、凋亡、遷移及侵襲能力的改變。(1)利用流式細(xì)胞術(shù)(PI染色)檢測(cè)NMBzA與MC-LR單獨(dú)及聯(lián)合染毒24h后細(xì)胞周期的改變。結(jié)果顯示,NMBzA與MC-LR具有交互作用,NMBzA與MC-LR單獨(dú)染毒組及聯(lián)合染毒組均表現(xiàn)為G1期縮短,S期和G2期延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示細(xì)胞可能阻滯在S期,DNA合成增加,增殖失控。(2)利用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC標(biāo)記)檢測(cè)NMBzA與MC-LR單獨(dú)及聯(lián)合染毒24h后細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,NMBzA單獨(dú)染毒組促進(jìn)細(xì)胞凋亡,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NMBzA與MC-LR聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞凋亡的影響沒(méi)有交互作用。(3)采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示,NMBzA 與 MC-LR具有交互作用,MC-LR可促進(jìn)細(xì)胞遷移,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NMBzA與MC-LR 均可促進(jìn)細(xì)胞侵襲,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞侵襲。2.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對(duì)食管癌EC109細(xì)胞惡性表型的影響根據(jù)HET-1A細(xì)胞得到的兩毒物聯(lián)合作用結(jié)果,分別設(shè)立低、中、高三個(gè)劑量組單獨(dú)及聯(lián)合染毒EC109細(xì)胞24h,檢測(cè)不同劑量?jī)啥疚飭为?dú)及聯(lián)合染毒對(duì)EC109細(xì)胞周期、凋亡、遷移及侵襲能力的影響。(1)利用流式細(xì)胞術(shù)(PI染色)檢測(cè)NMBzA與MC-LR單獨(dú)及聯(lián)合染毒24h后細(xì)胞周期的改變。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各染毒組細(xì)胞G1期縮短,S期延長(zhǎng)(P0.05),表明細(xì)胞阻滯在S期,出現(xiàn)了一定程度的增殖失控。(2)利用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC標(biāo)記)檢測(cè)NMBzA與MC-LR單獨(dú)及聯(lián)合染毒24h后細(xì)胞凋亡率。低劑量組對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著改變,中劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合抑制細(xì)胞凋亡(P0.05),高劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.05)。(3)使用Transwell小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力,低劑量組細(xì)胞遷移和侵襲能力無(wú)顯著改變,中、高劑量組MC-LR和NMBzA協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲(P0.05)。3、甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對(duì)]HET-1A細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制研究3.1不同食管細(xì)胞內(nèi)OATP1B1和OATP1B3的表達(dá)情況收集己染毒10代和20代的HET-1A細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定OATP1B1和OATP1B3在不同食管細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中都有表達(dá),與正常食管上皮細(xì)胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌細(xì)胞C17、EC109、EC9706內(nèi)表達(dá)均增加(P0.05)；OATP1B3在食管癌細(xì)胞EC109、EC9706內(nèi)表達(dá)均增加(P0.05)。3.2甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒調(diào)控信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因PP2A和Ras基因的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)已染毒10代和20代的HET-1A細(xì)胞內(nèi)調(diào)控通路節(jié)點(diǎn)基因PP2A和Ras基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。(1)對(duì)于PP2A基因,染毒10代時(shí)尚不能認(rèn)為NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨(dú)染毒促進(jìn)PP2A表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,染毒20代時(shí)NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨(dú)染毒促進(jìn)PP2A表達(dá),MC-LR單獨(dú)染毒抑制PP2A表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)對(duì)于Ras基因,染毒10代時(shí)可以認(rèn)為NMBzA與MC-LR存在交互作用,NMBzA單獨(dú)染毒促進(jìn)Ras表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,染毒20代時(shí)NMBzA與MC-LR也存在交互作用,NMBzA與MC-LR單獨(dú)染毒均促進(jìn)Ras基因表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且聯(lián)合染毒組Ras表達(dá)明顯高于兩毒物的表達(dá),提示兩毒物可協(xié)同促進(jìn)Ras基因的表達(dá)。3.3甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒信號(hào)通路分析應(yīng)用Western Blotting半定量技術(shù)測(cè)定己染毒10代和20代的HET-1A細(xì)胞內(nèi)MAPK家族成員ERK、JNK和P38MAPK,MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子ELK1和c-Myc,P53通路中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53、Cdc25C和Cdc2以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平表達(dá)。(1)ERK蛋白的磷酸化表達(dá)水平在MC-LR單獨(dú)染毒組明顯升高,并且隨著MC-LR染毒代數(shù)的增加呈現(xiàn)出依賴性,在NMBzA單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組先降低后增加,在聯(lián)合染毒組表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；JNK蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加而增加,在20代的聯(lián)合染毒組表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P38 MAPK蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加呈降低趨勢(shì)；提示NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒可以通過(guò)激活ERK和JNK蛋白的磷酸化激活MAPK通路。(2)ELK1蛋白的磷酸化水平隨染毒代數(shù)增加先降低后增加,在20代的聯(lián)合染毒組表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；c-Myc在MC-LR單獨(dú)染毒組和聯(lián)合染毒組磷酸化水平均隨染毒代數(shù)增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明聯(lián)合染毒組確實(shí)可以激活MAPK通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。(3)對(duì)于P53基因的mRNA表達(dá),染毒10代時(shí)尚不能認(rèn)為NMBzA與MC-LR存在交互作用,染毒20代時(shí)NMBzA與 MC-LR存在交互作用,NMBzA與MC-LR均促進(jìn)P53表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但聯(lián)合染毒組P53表達(dá)明顯降低,提示兩毒物可協(xié)同抑制P53基因的表達(dá),P53 (Ser37)蛋白表達(dá)也與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。Cdc25C蛋白的磷酸化水平在聯(lián)合染毒組中隨染毒代數(shù)增加而增加,在20代的聯(lián)合染毒組中表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；磷酸化的Cdc2蛋白(Ser37)表達(dá)水平均隨染毒代數(shù)增加而降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒引起細(xì)胞阻滯,DNA合成增加,使細(xì)胞周期呈現(xiàn)出一定程度的增殖失控。(4)Bcl-2蛋白表達(dá)量、Bax蛋白表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值均隨染毒代數(shù)增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示細(xì)胞凋亡趨勢(shì)逐漸減弱,從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)論：1.甲基芐基亞硝胺單獨(dú)染毒可以誘發(fā)F344大鼠出現(xiàn)癌前病變,微囊藻毒素單獨(dú)染毒無(wú)法誘發(fā)癌前病變,但可在甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒中發(fā)揮促癌劑作用促進(jìn)甲基芐基亞硝胺的食管癌癌前病變作用。2.甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合低劑量具有拮抗效應(yīng),高劑量具有協(xié)同效應(yīng)。甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素可協(xié)同促進(jìn)正常食管上皮細(xì)胞HET-1A細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素可協(xié)同將細(xì)胞阻滯在S期,使細(xì)胞增殖失控；NMBzA促進(jìn)細(xì)胞凋亡；MC-LR可促進(jìn)細(xì)胞遷移；NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞侵襲。3.不同劑量甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素染毒食管癌細(xì)胞時(shí),可協(xié)同將細(xì)胞阻滯在S期,使細(xì)胞增殖失控；中劑量組聯(lián)合抑制細(xì)胞凋亡,高劑量組NMBzA與MC-LR聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡；NMBzA與MC-LR可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。4.有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中都有表達(dá),與正常食管上皮細(xì)胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌細(xì)胞C17、EC109、 EC9706內(nèi)表達(dá)均增加；OATP1B3在食管癌細(xì)胞EC109、EC9706內(nèi)表達(dá)均增加。5.與對(duì)照組相比,甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素單獨(dú)及聯(lián)合染毒組PP2A表達(dá)降低,Ras表達(dá)增加。表明NMBzA和MC-LR聯(lián)合染毒可以通過(guò)抑制PP2A表達(dá)和促進(jìn)Ras表達(dá)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。6.甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒可以通過(guò)激活MAPK通路,促進(jìn)MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子ELK1和c-Myc的表達(dá)；抑制P53的表達(dá),促進(jìn)Cdc25C蛋白的表達(dá),抑制Cdc2蛋白表達(dá)使細(xì)胞阻滯,DNA合成增加,細(xì)胞增殖失控。Bcl-2蛋白表達(dá)量、Bax蛋白表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值均隨染毒代數(shù)增加而增加,凋亡趨勢(shì)逐漸減弱,從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：亞硝胺 微囊藻毒素 食管癌 聯(lián)合作用
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R123
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 縮略詞表17-19
• 前言19-22
• 第一章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)大鼠致癌實(shí)驗(yàn)22-27
• 1 材料和方法22-23
• 2 結(jié)果23-25
• 3 討論25-27
• 第二章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響27-43
• 第一節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒誘發(fā)正常食管上皮HET-1A細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化27-37
• 第二節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒對(duì)食管癌EC109細(xì)胞惡性表型的影響37-43
• 第三章 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒影響食管癌發(fā)病的機(jī)制研究43-58
• 第一節(jié) 不同食管細(xì)胞內(nèi)OATP1B1和OATP1B3的表達(dá)情況43-48
• 第二節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒調(diào)控信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)基因PP2A和Ras基因的表達(dá)48-49
• 第三節(jié) 甲基芐基亞硝胺和微囊藻毒素聯(lián)合染毒信號(hào)通路分析49-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 綜述 亞硝胺類消毒融產(chǎn)物和微囊藻毒素與食管癌發(fā)生關(guān)系的研究進(jìn)展63-74
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 作者簡(jiǎn)介74-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：1040755