發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 22:34

【摘要】：研究背景:腸道病毒(enterovirus,EV)歸屬于小RNA病毒目小RNA病毒科中的腸道病毒屬。目前已經(jīng)報(bào)道的EV有116種血清型,分屬于15個(gè)組:EV-A至EV-L,以及鼻病毒A-C組。腸道病毒為無包膜病毒,在酸性環(huán)境中穩(wěn)定,對(duì)紫外線敏感,目前實(shí)驗(yàn)室常用的EV滅活方式包括熱力滅活、紫外線照射、含氯消毒劑及甲醛熏蒸等方式。Echovirus 11作為EV-B的一員,是較常分離到的EV,疾病譜分布廣泛:從輕度非特異性癥狀到全身性疾病,如皮疹,發(fā)熱,手足口病(Handfoot,andmouthdisease,HFMD),葡萄膜炎(uveitis)和嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括無菌性腦膜炎,腦炎和急性遲緩性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)等。特別是導(dǎo)致新生兒敗血癥樣癥狀(sepsis-likedisease)和多器官系統(tǒng)出血(multisystem hemorrhagic disease)的發(fā)生,其高病死率引起社會(huì)恐慌。文獻(xiàn)提示,有關(guān)E-11流行病學(xué)和基因特征及實(shí)驗(yàn)室EV滅活效果評(píng)價(jià)方面的研究仍比較匱乏。僅有的E-11基因特征研究在地理分布和時(shí)間跨度上也較為局限,本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)對(duì)1999年西藏自治區(qū)和1999-2003年山東省AFP病例中分離得到的E-11毒株進(jìn)行過相關(guān)研究,本研究在此基礎(chǔ)上依托HFMD網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測技術(shù)平臺(tái),首次對(duì)中國大陸分離得到的E-11毒株進(jìn)行流行病學(xué)、基因特征及遺傳進(jìn)化等方面的系統(tǒng)研究;并在EV生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室(Biosafety laboratory-2,BSL-2)中首次對(duì)EV常用滅活方式進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。研究目的:闡明我國E-11的流行規(guī)律,建立E-11 VP1全長及全基因組序列的測定方法,更新E-11基于VP1全長的基因分型結(jié)果,系統(tǒng)掌握E-11不同基因型別毒株在全球及全國范圍內(nèi)的分布及流行規(guī)律,完善對(duì)其基因重組及遺傳進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識(shí),為E-11的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為相關(guān)疾病的預(yù)警預(yù)測及預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。系統(tǒng)評(píng)價(jià)EV常用滅活方式的滅活效果,建立BSL-2實(shí)驗(yàn)室表面消毒技術(shù),確保實(shí)驗(yàn)操作人員安全,為生物安全管理提供可靠數(shù)據(jù)。研究方法:基于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所建立的中國大陸AFP、HFMD網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測技術(shù)平臺(tái),收集1999-2003年,2008-2017年中國大陸由E-11引起的共59例AFP及HFMD病例信息,并擴(kuò)增全部E-11 VP1全長序列。同時(shí)收集篩選GenBank數(shù)據(jù)庫500條國內(nèi)外E-11 VP1編碼區(qū)全長序列,建立E-11 VP1區(qū)全長序列數(shù)據(jù)集;對(duì)從HFMD網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室檢測平臺(tái)獲得的17株E-11毒株進(jìn)行全基因組測序,使用Sequencher、MEGA、Bioedit、Simplot軟件對(duì)其基因序列特征,重組情況和進(jìn)化規(guī)律等特征進(jìn)行系統(tǒng)分析。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),將滅活處理后的病毒接種于細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度實(shí)驗(yàn),通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),并利用behrens-karber法計(jì)算滅活后EV的TCID5o,評(píng)價(jià)EV熱力滅活及常用消毒劑的滅活效果。研究結(jié)果:1.截止至2018年12月5日,共收集到國內(nèi)外E-11 VP1區(qū)核苷酸序列全長559條,其中包含分離至六大洲33個(gè)國家,時(shí)間跨度為1953-2014年度,來源于11種疾病類型的E-11 VP1區(qū)全長序列359條和分離至中國大陸1994-2017年12個(gè)省份(自治區(qū))的200條E-11VP1區(qū)核苷酸全長序列。其中59條為本實(shí)驗(yàn)室分離株:41株來源于本實(shí)驗(yàn)室前期基于AFP網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測技術(shù)平臺(tái),18株來源于HFMD網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測平臺(tái)。HFMD來源的18株E-11毒株中有4株為重癥HFMD,分離至2012年廣東省,2010年湖南省,海南省和2017年河北省。2.基于VP1區(qū)核苷酸序列全長,按照腸道病毒基因型別劃分標(biāo)準(zhǔn)將E-11劃分為A-F六個(gè)基因型,基因型A,C和D可被進(jìn)一步劃分為A1-A5,C1-C4和D1-D5基因亞型。其中基因型F是本研究劃分的新基因型,D5基因亞型在HFMD中的檢出為國內(nèi)首次報(bào)道。3.除中國大陸外共獲得六大洲33個(gè)國家,時(shí)間跨度為1953-2014期間的359株E-11毒株,經(jīng)分型鑒定后分布于A4-A5、B、C2、C4、D1-D5和F基因(亞)型中。D5基因亞型為1998-2014年度國外流行的優(yōu)勢基因亞型,首次于1998年分離于Tunsia。4.中國大陸分離至1994-2017年度的200株E-11經(jīng)分型鑒定后,分布于A1-A3、B、C1、C3、D5和E基因(亞)型中,A1基因亞型為2008-2017年度中國大陸流行的優(yōu)勢基因亞型。A1基因亞型自2006年首次從AFP病例中被分離后,至2017年一直有持續(xù)性流行。5.將HFMD來源的可獲得全長序列的17株E-11毒株根據(jù)不同基因型別和不同疾病類型進(jìn)行重組分析。本實(shí)驗(yàn)分離到的輕、重癥病例D5基因亞型分離株的重組方式相同,表現(xiàn)為在3C區(qū)與EV-B100和EV-B111發(fā)生重組,在3D區(qū)與EV-B86發(fā)生重組;A1基因亞型輕、重癥病例分離株間的重組模式存在差異,輕癥病例A1基因亞型分離株的重組方式與D5基因亞型分離株相同,3株重癥病例A1基因亞型分離株存在兩種不同的重組模式,一種以HaN-2010-165和HuN-2010-112為代表,表現(xiàn)為5'-UTR與EV-B98發(fā)生重組,另一種以GD-2012-34為代表,表現(xiàn)為5'-UTR與EV-B74,3D區(qū)與EV-B86存在重組;除與EV-B原型株存在重組外,中國大陸E-11分離株還與近幾年流行的其他EV-B流行株發(fā)生重組,重組活動(dòng)頻繁。6.腸道病毒熱力滅活方式顯示,56℃加熱滅活30min后可使EV-A71病毒的滅活對(duì)數(shù)值超過6,65℃加熱滅活30min,70℃加熱滅活10min后觀察不到CPE發(fā)生,建立滅活溫度和處理時(shí)間的多重線性回歸方程,結(jié)果顯示溫度每提高10℃,EV-A71病毒滴度下降約1.7個(gè)TCID50,滅活作用時(shí)間每提高10分鐘,EV-A71病毒滴度下降約0.2個(gè)TCID50;化學(xué)消毒劑滅活效果評(píng)價(jià)顯示,三氯異氰尿酸泡騰片,virkon消毒粉和新型消毒劑次氯酸分子可以有效滅活EV-A71病毒。研究結(jié)論:1、基于E-11 VP1編碼區(qū)全長序列,可將其劃分為A-F共六個(gè)基因型,其中F基因型為本研究劃分的新的基因型別,分離至非洲中西部的內(nèi)陸國家;D5基因亞型的E-11毒株在中國HFMD中的檢出為國內(nèi)首次報(bào)道。2、1994-2017年度中國大陸分離到的200株E-11毒株可以被劃分到A1-A3,B,C1,C3,D5,E基因型,存在多個(gè)E-11基因型的循環(huán),其中A1-A3為中國大陸本土流行株,暫未見其他國家報(bào)道。3、分子流行病學(xué)分析顯示,A1基因亞型是2008-2017年期間中國大陸流行的優(yōu)勢基因型別,以1999年和2008年為時(shí)間節(jié)點(diǎn),中國大陸流行的E-11基因型別可能發(fā)生了較為明顯的轉(zhuǎn)變:持續(xù)流行的基因型別由C1轉(zhuǎn)變?yōu)锳2,再轉(zhuǎn)變?yōu)锳1基因亞型。4、除中國大陸外其他國家分離到的E-11毒株的基因型分布可能在1998年前后發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變,由D4基因亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镈5基因亞型的持續(xù)性流行,1998-2014年期間D5基因亞型是國外分離株的絕對(duì)優(yōu)勢基因型。5、基因重組:本研究提示中國大陸HFMD來源的E-11毒株在5'-UTR區(qū)和3D區(qū)與其他EV-B新型腸道病毒發(fā)生重組,A1基因亞型分離株重組方式較D5基因亞型多,可能在其成為優(yōu)勢基因亞型過程中起著重要作用;HFMD來源的E-11毒株與近年流行的其他EV-B流行株重組活動(dòng)頻繁,且不乏與暴發(fā)事件分離株發(fā)生重組,成為其將來導(dǎo)致疾病暴發(fā)流行的潛在隱患。6、熱力和化學(xué)消毒劑對(duì)EV-A71的滅活效果與滅活溫度、消毒劑濃度和處理作用時(shí)間等因素有關(guān),研究化學(xué)消毒劑對(duì)EV-A71的滅活曲線對(duì)于指導(dǎo)化學(xué)消毒劑濃度和處理作用時(shí)間的選擇具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R197.21
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋３、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ＶＰ１邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋９４逡逑Ｅ－ｌｌ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｓｔｒａｉｎｓ逡逑４３逡逑

將２．１．２中所述的附表２中的２００條中國大陸序列用同樣的方法構(gòu)建基于Ｅ－１１全長逡逑區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，將２００８？２０１７年中國大陸的序列分支分別用不同的顏色進(jìn)行標(biāo)注，逡逑２００８年以前的中國大陸分離株不標(biāo)注顏色，最終得到圖４中的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其分離株的逡逑樣本來源，分離時(shí)間和地區(qū)等信息歸納于表９中。逡逑表８、２００株中國大陸分離株的信息匯總表逡逑Ｔａｂｌｅ邋８．邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋２００邋￡－１１邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｏｆ邋ｍａｉｎｌａｎｄ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎａ逡逑＿樣本分離來源丨基因（亞）型（數(shù)ｇ）邐分離時(shí)間邐省份逡逑Ａｌ（２０）邐２００６，邋２００８－２０１０邐山東，四川逡逑１９９９－２００１，２００３－２００４，山東，云南，四逡逑Ａ２（３７）邐２００６－２００７邐ＪＩＩ邐逡逑ＡＦＰ邐Ａ３（２）邐１９９４，邐１９９６邐Ｍ邐逡逑１９９４－１９９５，邋１９９７，逡逑Ｃｌ（１５）邐１９９９－２０００邐山東，西藏逡逑邐Ｅ（４）邐１９９９邐Ｍ邐逡逑云南，湖南陜逡逑西

中國大陸E一n與Ev-B原型株基于P2非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

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本文編號(hào)：2791112