本文關鍵詞：內質網(wǎng)應激—自噬在微囊藻毒素-LR誘導CHO細胞凋亡中的作用

  更多相關文章： 微囊藻毒素-LR 中國倉鼠卵巢細胞 內質網(wǎng)應激 自噬 凋亡

【摘要】：背景與目的微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是最常見的藻類毒素,目前已發(fā)現(xiàn)有90多種異構體,其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)是最常見的、毒性最強的異構體。MC-LR對魚類和體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞具有雌激素樣作用,是一種內分泌干擾物,而內分泌干擾物可導致體內激素水平紊亂進而影響人類、魚類、哺乳動物的正常繁殖、生長發(fā)育。隨著環(huán)境污染的加重,人類生育能力的降低與環(huán)境暴露的關系受到全球范圍內的關注,MCs對生殖細胞的毒性作用及其機制成為環(huán)境毒理學的一大熱點。但目前關于MCs誘導生殖系統(tǒng)損傷方面的研究主要集中于雄性生殖系統(tǒng),其毒性機制也多局限于線粒體通路的研究,而內質網(wǎng)應激-自噬信號通路在MCs對雌性生殖系統(tǒng)毒性作用機制尚不十分明確。深入研究內質網(wǎng)應激-自噬信號通路在MCs對生殖系統(tǒng)毒性作用機制,對保護生殖健康、預防和治療相關生殖系統(tǒng)疾病有著極其重要的現(xiàn)實意義和前瞻性意義。方法1.應用水溶性四唑鹽(WST)-8法,采用CCK-8試劑盒,檢測1,5,10,15,20,30μM MC-LR作用中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster cells,CHO)24h后細胞增殖抑制率的變化,計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),設置IC50/4、IC50/2、IC50為后續(xù)實驗濃度。2.碘化丙啶染色法聯(lián)合流式細胞術,檢測不同濃度MC-LR染毒CHO細胞24 h后細胞周期的變化;3.用2’,7’-二氯熒光素乙酰乙酸鹽(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針法聯(lián)合流式細胞術,定量檢測不同濃度MC-LR染毒CHO細胞24 h后細胞內活性氧熒光強度值變化;4.采用熒光探針Fluo3-AM法和流式細胞術,檢測不同濃度MC-LR和ROS抑制劑NAC+不同濃度MC-LR處理CHO細胞24 h后細胞內Ca~(2+)的含量;5.采用單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法,應用活細胞工作站和流式細胞術檢測不同濃度MC-LR處理CHO細胞24 h后細胞內自噬小體的含量;6.采用蛋白免疫印記技術檢測不同濃度MC-LR以及內質網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)+IC50 MC-LR染毒24 h后,CHO細胞中內質網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78、ATF-6、IRE1、XBP1、CHOP和自噬標志性蛋白LC3B、Beclin1蛋白相對表達量變化;7.使用Annexin V-PE/7-ADD雙染色法及流式細胞儀,檢測不同濃度MC-LR以及4-PBA/3-MA+IC50 MC-LR染毒CHO細胞24 h凋亡率的變化。8.所有計算和統(tǒng)計分析均采用SPSS 21.0 for Windows統(tǒng)計軟件包,多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One Way ANOVA)。進行組間兩兩比較時,若方差齊時,采用Student-Newman-Keuls test(SNK)檢驗;若方差不齊時,采用Games-Howell檢驗。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.細胞增殖檢測結果在本次實驗的MC-LR作用濃度和時間下,MC-LR能抑制CHO細胞增殖,隨著MC-LR濃度的升高,和對照組(0μM MC-LR)相比,細胞增殖受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經(jīng)計算MC-LR作用CHO細胞24 h時IC50為10μM,后續(xù)實驗濃度分別為:2.5μM,5μM和10μM。2.細胞周期實驗結果濃度為0,2.5,5,10μM MC-LR作用于CHO細胞24 h后,處于G_2/M的CHO細胞隨著MC-LR染毒濃度的增加顯著增加(P0.05),提示MC-LR能夠使CHO細胞周期紊亂,從而引起細胞增殖率降低。3.ROS測定結果MC-LR染毒CHO細胞24 h后,隨著染毒濃度的增加,細胞內熒光強度逐漸增強,也反映出CHO細胞內ROS含量升高,染毒組與對照組(0μM)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.細胞內Ca~(2+)實驗結果MC-LR染毒CHO細胞24 h后,隨著MC-LR濃度的增加,CHO細胞內Ca~(2+)熒光強度逐漸升高,且各染毒組結果與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。各實驗組CHO細胞在MC-LR染毒前1 h預染了ROS的抑制劑NAC后再染毒24 h,檢測細胞內Ca~(2+)含量,實驗結果顯示雖然隨著染毒濃度的增加,Ca~(2+)熒光強度逐漸增強,但NAC+染毒組與對應染毒組相比,熒光強度全有所下降,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.自噬小體檢測結果隨著MC-LR濃度的增高,細胞內自噬小體的數(shù)量和亮度都逐漸增加。流式檢測結果顯示當暴露時間一定時,隨著MC-LR濃度的升高,CHO細胞內自噬小體的含量呈逐漸上升趨勢,且和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.內質網(wǎng)應激和自噬標志性蛋白實驗結果Western blot結果分析顯示濃度為2.5,5,10μM MC-LR組內質網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78、ATF-6、PERK、IRE1、CHOP表達都升高,自噬標志性蛋白Beclin1和LC3II表達升高,LC3I表達降低,且與對照0μM MC-LR組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);10μM MC-LR染毒組在預先1 h分別加入自噬抑制劑3-MA和內質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA時,自噬抑制劑3-MA能夠升高內質網(wǎng)應激標志性蛋白的表達,而內質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA能降低自噬標志性蛋白的表達。實驗結果表明,MC-LR誘導的CHO細胞凋亡過程中,內質網(wǎng)應激的發(fā)生能促進自噬的發(fā)生,而自噬增強能夠抑制內質網(wǎng)應激的發(fā)生。7.細胞凋亡率檢測結果MC-LR能增加CHO細胞的早期和晚期凋亡率,總凋亡率隨著染毒濃度的增加而增加,與對照組(0μM)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。當10μM MC-LR組預先1 h加入內質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA時,CHO細胞凋亡率明顯降低;10μM MC-LR實驗組預先1 h加入自噬抑制劑3-MA時,CHO細胞凋亡率明顯增加,且與10μM組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1.在MC-LR處理的CHO細胞中,MC-LR可明顯抑制細胞增殖,引起細胞周期阻滯在G_2/M期,并誘導其凋亡;2.MC-LR能誘導CHO細胞ROS增多,從而促進Ca~(2+)水平升高,可能引起內質網(wǎng)應激的發(fā)生;3.內質網(wǎng)應激通路促進凋亡的發(fā)生,而自噬作為一種保護機制能抑制凋亡的發(fā)生,內質網(wǎng)應激-自噬在MC-LR誘導CHO細胞凋亡過程起著重要作用。
【關鍵詞】：微囊藻毒素-LR 中國倉鼠卵巢細胞 內質網(wǎng)應激 自噬 凋亡
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R99
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 縮略詞表14-15
• 1 前言15-17
• 2 材料與方法17-26
• 2.1 實驗材料17-19
• 2.1.1 實驗細胞17
• 2.1.2 主要試劑與耗材17-18
• 2.1.3 主要試劑的配制18
• 2.1.4 主要儀器與設備18-19
• 2.2 實驗方法19-25
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)19
• 2.2.2 細胞增殖抑制率的測定19-20
• 2.2.3 細胞周期的測定20
• 2.2.4 活性氧的測定20-21
• 2.2.5 Ca~(2+)的測定21
• 2.2.6 自噬小體的測定21
• 2.2.7 細胞凋亡率的測定21-22
• 2.2.8 Western blot22-25
• 2.3 統(tǒng)計學分析25-26
• 3 實驗結果26-42
• 3.1 不同濃度MC-LR抑制CHO細胞增殖26-27
• 3.2 MC-LR誘導細胞周期阻滯在G_2/M期27-28
• 3.3 不同濃度MC-LR誘導CHO細胞內ROS產生28-30
• 3.4 不同濃度MC-LR對CHO細胞質內Ca~(2+)的影響30-31
• 3.5 不同濃度MC-LR誘導CHO細胞質內自噬小體增加31-33
• 3.6 內質網(wǎng)應激-自噬標志性蛋白表達隨著MC-LR濃度而改變33-36
• 3.7 MC-LR通過內質網(wǎng)應激-自噬途徑引起細胞凋亡36-38
• 3.8 MC-LR誘導CHO細胞凋亡中內質網(wǎng)應激和自噬的關系38-42
• 4 討論42-49
• 4.1 MC-LR能不同程度的抑制細胞增殖42-43
• 4.2 MC-LR使CHO細胞周期阻滯在G_2/M期43-44
• 4.3 MC-LR誘導CHO細胞ROS升高和Ca~(2+)增多44-45
• 4.4 MC-LR誘導CHO細胞內自噬小體增多45-46
• 4.5 MC-LR致CHO細胞中內質網(wǎng)應激-自噬標志性蛋白表達改變46-47
• 4.6 MC-LR通過內質網(wǎng)應激-自噬途徑誘導CHO細胞凋亡47-49
• 5 結論49-50
• 參考文獻50-56
• 綜述56-73
• 1 UPR的發(fā)現(xiàn)及其傳感器的下游信號轉導通路56-58
• 2 PERK的分子結構和激活58-59
• 3 PERK在內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡中的作用59-62
• 4 PERK在內質網(wǎng)應激誘導的自噬的作用62-64
• 5 小結與展望64-65
• 參考文獻65-73
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究73-75
• 致謝75

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