發(fā)布時(shí)間：2017-09-11 09:37

  本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯ATPR誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化中的作用

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【摘要】：蛋白酪氨酸磷酸酶(Shp2)是最早被定義為癌基因的酪氨酸磷酸酶,參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其突變與不同類型的白血病及實(shí)體瘤的發(fā)生密切相關(guān)。全反式維甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)作為分化誘導(dǎo)劑的代表已廣泛應(yīng)用于臨床上治療急性早幼粒性白血病。但長(zhǎng)期使用ATRA會(huì)導(dǎo)致維甲酸綜合征、耐藥性等不良反應(yīng),制約了其在臨床上廣泛應(yīng)用。課題組前期對(duì)ATRA的碳鏈末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,獲得一系列衍生物,經(jīng)過大量藥效學(xué)篩選,發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性,可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化成熟,有望成為一種新型誘導(dǎo)分化劑。本研究在確證ATPR誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞分化作用的基礎(chǔ)上,利用小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾K562細(xì)胞中Shp2基因,建立Shp2表達(dá)沉默模型,旨在觀察Shp2在ATPR誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過程中所起的作用,闡明ATPR抗腫瘤作用的可能機(jī)制。目的：觀察蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在新型維甲酸衍生物ATPR誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病K562分化過程中所起的作用。方法：1.ATPR對(duì)K562細(xì)胞增殖分化及Shp2表達(dá)的影響：選取慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,CCK-8法觀察ATPR對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響：瑞氏吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和特異性分化抗原CD235a的表達(dá)；采用Q-RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞中蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2mRNA和蛋白的表達(dá)。2.采用siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建Shp2沉默模型：通過化學(xué)合成法合成特異性熒光短鏈Shp2 siRNA-FAM,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將Shp2 siRNA轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞,采用熒光顯微鏡、Western Blot法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率及其對(duì)Shp2蛋白表達(dá)的抑制作用,選取最佳Shp2 siRNA-FAM。3.Shp2沉默對(duì)ATPR誘導(dǎo)K562分化作用的影響：實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(RPMI-1640)、陽(yáng)性藥對(duì)照組ATRA(濃度為10-5mol/L)、實(shí)驗(yàn)組ATPR組(濃度為10-5mol/L)、Shp2沉默不加藥組(siRNA-lipo)、siRNA-lipo+ATRA組以及siRNA-lipo+ATPR組。CCK-8法觀察ATPR對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響；瑞氏-吉姆薩染色法在倒置相差顯微鏡下觀察加藥處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期的變化及特異性分化指標(biāo)CD235a的表達(dá)變化。4.Shp2沉默對(duì)ATPR誘導(dǎo)維甲酸受體表達(dá)的影響：分為空白對(duì)照組(等體積RPMI-1640)、陽(yáng)性藥對(duì)照組ATRA(濃度為10-5mol/L)、實(shí)驗(yàn)組ATPR組(濃度為10-5mol/L)、Shp2沉默不加藥組(siRNA-lipo)、siRNA-lipo+ATRA組以及siRNA-lipo+ATPR組。采用Q-PCR和Western Blot法檢測(cè)ATPR對(duì)K562細(xì)胞維甲酸受體mRNA表達(dá)和蛋白水平的影響。結(jié)果：1.ATPR (10-5mol/L)作用72h后,觀察K562細(xì)胞,與對(duì)照組比較,細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)明顯變化,細(xì)胞向分化成熟方向變化；細(xì)胞周期方面,細(xì)胞S期所占比例減少,細(xì)胞Go/G1期所占比例增多,細(xì)胞滯留在Go/G1期；細(xì)胞特異性分化抗原CD235a表達(dá)明顯升高；K562細(xì)胞中Shp2的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯下降。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的3條Shp2-siRNA鏈均能成功轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞,其中siRNA-A鏈(PTPN-Homo-438)和siRNA-C (PTPN-Homo-1493)轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞效果更好,且Western Blot結(jié)果顯示,PTPN-Homo-438與lipo比例為1：0.05時(shí)Shp2蛋白表達(dá)最低,故選用此條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3.ATPR(10-5mol/L)作用于轉(zhuǎn)染沉默Shp2的K562細(xì)胞72h后,CCK-8法結(jié)果顯示ATPR能抑制K562細(xì)胞的增殖,但當(dāng)Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后ATPR對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯；瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化顯示當(dāng)Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后,ATPR對(duì)K562的作用沒有出現(xiàn)單獨(dú)使用ATPR時(shí)所出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示ATPR用藥后K562細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞所占比例增加,S期所占比例減少,但當(dāng)Shp2表達(dá)沉默后,變化不明顯；流式細(xì)胞儀檢測(cè)特異性分化指標(biāo)CD235a的表達(dá)變化也出現(xiàn)類似情況。4.ATPR (10-5mol/L)作用72h后,Q-RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在K562細(xì)胞中,RARa的表達(dá)降低,RARγ表達(dá)升高,RARβ的表達(dá)變化不明顯。當(dāng)Shp2被轉(zhuǎn)染沉默后,RARα、RARγ的mRNA表達(dá)和蛋白水平與空白組相比均沒有明顯變化。結(jié)論：1.ATPR對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化的作用。2.siRNA-A鏈(PTPN-Homo-438)沉默K562細(xì)胞中Shp2基因效果較好。3.沉默Shp2可抑制ATPR誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的作用。
【關(guān)鍵詞】：4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 蛋白酪氨酸磷酸酶 K562細(xì)胞 白血病 誘導(dǎo)分化 維甲酸受體
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一部分 ATPR對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及其Shp2表達(dá)的影響13-38
• 1 前言13-15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 3 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 4 結(jié)果25-32
• 5 討論32-34
• 6 小結(jié)34
• 參考文獻(xiàn)34-38
• 第二部分 蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2沉默后4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化作用的影響38-57
• 1 前言38-39
• 2 實(shí)驗(yàn)材料39-41
• 3 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-53
• 5 討論53-54
• 6 小結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 附錄57-58
• 致謝58-60
• 綜述60-76
• 參考文獻(xiàn)70-76

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