本文關(guān)鍵詞：長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體的制備及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性作用研究

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【摘要】：長春新堿是一種一線抗癌藥物,常以硫酸鹽形式存在,臨床應用廣泛,但是長春新堿對神經(jīng)系統(tǒng)尤其是外周神經(jīng)的毒性以及易產(chǎn)生耐藥性限制了其在臨床上的應用�？鼘幨莻鹘y(tǒng)的抗瘧藥物,但是已有研究發(fā)現(xiàn)其具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。因此,為了提高長春新堿對耐藥腫瘤的治療作用并減少毒副作用,本論文在探討奎寧逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機理的基礎(chǔ)上,制備了長春新堿與奎寧共載的脂質(zhì)體。具體研究工作分成以下幾個部分：本論文首先探討了奎寧在A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A三種耐藥細胞中的逆轉(zhuǎn)耐藥機制,主要考察了奎寧對細胞中ATP含量及ATP酶活性的影響和奎寧對耐藥細胞中耐藥蛋白P-gp表達的影響。實驗結(jié)果表明奎寧可以降低三種耐藥細胞中ATP的含量并能降低細胞中ATP酶活性,證明奎寧是P-gp蛋白的底物。另外奎寧并能降低三種耐藥細胞中P-gp蛋白的表達量,顯示出顯著的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。基于長春新堿和奎寧的溶解度,本論文以大豆磷脂和膽固醇為原料,用薄膜水化法制備了長春新堿和奎寧的共載脂質(zhì)體,采用了Sephadex G-50凝膠柱層析法分離脂質(zhì)體與游離藥物以測定脂質(zhì)體的包封率,過程中以pH為7.4的PBS緩沖液為流動相進行洗脫,之后采用溶劑甲醇對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)進行破壞,使藥物逸出后,分別用HPLC法和UV法測定分離前后脂質(zhì)體中的長春新堿和奎寧的含量,計算兩種藥物的載藥量和包封率。同時考察了兩種藥物和磷脂的比例變化對包封率和載藥量的影響,發(fā)現(xiàn)長春新堿和奎寧的比例為1：2時,包封率和載藥量都相對較高,因此篩選為最佳的處方,用于后續(xù)實驗。繼而考察了脂質(zhì)體的一系列理化性質(zhì),包括外觀、粒徑、電位和形態(tài),結(jié)果顯示制備好的脂質(zhì)體的粒徑為62.47nm, PDI為0.283,另外考察脂質(zhì)體的體外藥物釋放行為,發(fā)現(xiàn)隨著pH的降低,長春新堿和奎寧在PBS種的釋放速率都有所增加,且不管是藥物共載脂質(zhì)體還是單載脂質(zhì)體混合,兩種藥物之間的釋放基本不會相互干擾。隨后本論文考察了共載脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤效果。首先通過MTT實驗測定了各個處方組對A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A三種耐藥細胞的細胞毒性,結(jié)果表明共載脂質(zhì)體在三種耐藥細胞上都有很強的逆轉(zhuǎn)耐藥效果,IC50達到0.095±0.008μg/mL、1.36±0.25μg/mL和2.95 ± 1.17μg/mL。同時考察了A549/T細胞、HCT-8/V細胞和MCF-7/A細胞在1h、2h、4h和8h四個時間點對長春新堿的攝取,通過HPLC方法測定細胞中長春新堿的含量,發(fā)現(xiàn)共載脂質(zhì)體組可以提高細胞對長春新堿的攝取。其次通過摸索,本論文構(gòu)建了A549/T細胞球模型和MCF-7/A細胞球模型,進一步考察了各處方組對細胞球的毒性,發(fā)現(xiàn)長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體相比其他組而言,同樣具有更強的細胞毒性。最后通過A549/T細胞裸鼠荷瘤模型,考察各組別藥物對荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用。結(jié)果顯示,長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體對腫瘤的抑制效果顯著優(yōu)于游離藥物組和脂質(zhì)體共混組,抑瘤率達到84.0%,體現(xiàn)了共載脂質(zhì)體在提高體內(nèi)抑瘤作用上的優(yōu)勢。綜上,長春新堿和奎寧的共載脂質(zhì)體能夠有效裝載藥物,并對A549/T、 HCT-8/V和MCF-7/A腫瘤的耐藥性顯示出顯著逆轉(zhuǎn)作用,制備長春新堿和奎寧的共載脂質(zhì)體具有一定的應用前景和臨床意義。
【關(guān)鍵詞】：長春新堿 奎寧 脂質(zhì)體 共載 多藥耐藥性 耐藥逆轉(zhuǎn) P-gp
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 縮略語10-15
• 前言15-20
• 第一章 奎寧逆轉(zhuǎn)耐藥的機制的初步探討20-35
• 1.1 材料與儀器20-22
• 1.1.1 材料20-22
• 1.1.2 儀器22
• 1.2. 實驗方法22-27
• 1.2.1 ATP含量測定22-24
• 1.2.2 P-gp相關(guān)的ATP酶活性實驗24-25
• 1.2.3 Western Blot實驗測定P-gp蛋白表達量25-27
• 1.3 實驗結(jié)果27-32
• 1.3.1 ATP含量測定27-29
• 1.3.2 P-gp相關(guān)的ATP酶活性實驗29-31
• 1.3.3 Western Blot實驗測定P-gp蛋白表達31-32
• 1.4 討論32-34
• 1.5 本章小結(jié)34-35
• 第二章 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的制備、表征及體外釋放35-57
• 2.1 材料與儀器35-37
• 2.1.1 材料35-36
• 2.1.2 儀器36-37
• 2.2 實驗方法37-51
• 2.2.1 脂質(zhì)體的制備38
• 2.2.1.1 空白脂質(zhì)體的制備38
• 2.2.1.2 硫酸長春新堿的脫鹽反應38
• 2.2.1.3 載藥脂質(zhì)體的制備38
• 2.2.2 硫酸長春新堿的含量測定方法38-41
• 2.2.2.1 檢測波長的選擇39
• 2.2.2.2 色譜條件的確定39
• 2.2.2.3 色譜行為39-40
• 2.2.2.4 線性范圍的考察40-41
• 2.2.3 一鹽酸奎寧的含量測定方法41-42
• 2.2.3.1 檢測波長的選擇41
• 2.2.3.2 干擾排除41
• 2.2.3.3 線性范圍的考察41-42
• 2.2.4 脂質(zhì)體包封率的測定及脂質(zhì)體的純化方法42-47
• 2.2.4.1 Sephadex G-50柱層析法分離脂質(zhì)體和游離藥物的方法建立43-46
• 2.2.4.2 Sephadex G-50柱層析法測定脂質(zhì)體包封率46-47
• 2.2.4.3 膜過濾法聯(lián)合透析法純化脂質(zhì)體47
• 2.2.5 脂質(zhì)體制備中藥物比例的篩選47-48
• 2.2.6 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的粒徑、粒徑分布及電位測定48
• 2.2.7 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的形態(tài)觀察48
• 2.2.8 單載脂質(zhì)體和共載脂質(zhì)體的體外釋放行為48-51
• 2.2.8.1 體外釋放樣品分析測定方法的建立48-50
• 2.2.8.2 脂質(zhì)體體外釋放行為的考察50-51
• 2.3 實驗結(jié)果與討論51-55
• 2.3.1 單載脂質(zhì)體和共載脂質(zhì)體的制備51
• 2.3.2 脂質(zhì)體制備中藥物比例的篩選51-52
• 2.3.3 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的粒徑及電位測定52-53
• 2.3.4 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的形態(tài)觀察53
• 2.3.5 單載脂質(zhì)體和共載脂質(zhì)體的體外釋放行為53-55
• 2.4 本章小結(jié)55-57
• 第三章 長春新堿與奎寧共載脂質(zhì)體的體外及體內(nèi)抗腫瘤效果評價57-82
• 3.1 材料與儀器57-60
• 3.1.1 材料57-59
• 3.1.2 儀器59-60
• 3.2 實驗方法60-69
• 3.2.1 細胞毒性實驗60-62
• 3.2.2 細胞對脂質(zhì)體的攝取實驗62-64
• 3.2.2.1 細胞培養(yǎng)62-63
• 3.2.2.2 樣品處理方法63
• 3.2.2.3 提取回收率的考察63
• 3.2.2.4 線性范圍的考察63
• 3.2.2.5 細胞對各處方中長春新堿的攝取情況63-64
• 3.2.3 體外多細胞腫瘤球?qū)嶒?/span>64-66
• 3.2.3.1 掃描電鏡(SEM)觀察多細胞腫瘤球形態(tài)64-65
• 3.2.3.2 多細胞腫瘤球增長抑制實驗65-66
• 3.2.4 體內(nèi)抗腫瘤藥效研究66-69
• 3.2.4.1 裸鼠的A549/T腫瘤模型構(gòu)建66
• 3.2.4.2 裸鼠體內(nèi)抗腫瘤藥效研究66-67
• 3.2.4.3 腫瘤組織的免疫組化檢查67-69
• 3.3 實驗結(jié)果與討論69-80
• 3.3.1 細胞毒性實驗69-72
• 3.3.2 細胞對脂質(zhì)體的攝取實驗72-75
• 3.3.3 體外多細胞腫瘤球?qū)嶒?/span>75-77
• 3.3.3.1 掃描電鏡(SEM)觀察多細胞腫瘤球形態(tài)75
• 3.3.3.2 多細胞腫瘤球增長抑制實驗75-77
• 3.3.4 體內(nèi)抗腫瘤藥效研究77-80
• 3.3.4.1 裸鼠體內(nèi)抗腫瘤藥效研究77-79
• 3.3.4.2 腫瘤組織的免疫組化檢查79-80
• 3.4 本章小結(jié)80-82
• 全文總結(jié)82-84
• 參考文獻84-91
• 綜述91-112
• 參考文獻105-112
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果112

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：647761