本文關(guān)鍵詞：γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株的選育及培養(yǎng)基的優(yōu)化

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【摘要】：γ-聚谷氨酸是由谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基脫水縮合連接而成的一種新型生物高分子材料,其具有卓越的吸水性能,最大吸水比例可達1:3500,這一性質(zhì)使其在化妝品、醫(yī)藥輔料、婦嬰用品等領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。此外,γ-聚谷氨酸還具有良好的生物相容性、延展性、可塑性等特點,極具開發(fā)及應(yīng)用潛力。但目前其菌種產(chǎn)率較低、生產(chǎn)成本較高,這在一定程度上限制了其在各領(lǐng)域的應(yīng)用及發(fā)展。本實驗旨在建立一種靈敏、簡便的γ-聚谷氨酸含量檢測方法,誘變選育出一株高產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株,并通過優(yōu)化其培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,達到降低生產(chǎn)成本的目的。本文以十六烷基三甲基溴化銨可在堿性條件下與γ-聚谷氨酸形成絡(luò)合物為理論基礎(chǔ),通過考察其絡(luò)合時間、絡(luò)合濃度及所用氫氧化鈉濃度等因素,最終確定了比濁法檢測γ-聚谷氨酸濃度的最佳條件為:十六烷基三甲基溴化銨濃度為6g/L,氫氧化鈉濃度為4%,最佳絡(luò)合時間為3min,檢測波長為250nm。在此條件下,建立標準曲線,方程為y=0.03245x-0.12367,R2為0.9977,重現(xiàn)性良好。采用豆粕作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別對碳源種類、碳氮比、氨基酸及氨基酸鹽、無機鹽離子、接種量、PH值等因素進行單因素試驗,篩選出對γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量影響較顯著的四個因素分別為:氨基酸及氨基酸鹽、無機鹽離子、pH值和接種量。通過四因素、三水平正交試驗,得到了最佳組合為谷氨酸6%,無機鹽離子添加量為0.2%,PH值為7.2,接種量為5%,以此組合進行驗證試驗,得到γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為62.40mg/g比未優(yōu)化之前的47.21mg/g提高了32.18%。對實驗室保藏菌株HG-009進行了物理誘變、化學誘變及復(fù)合誘變等誘變手段來提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。其中以紫外20W、10cm的條件誘變60s,將γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量由61.31mg/g提升到69.04mg/g。然后通過2%的DES 15min誘變,將γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量由61.90mg/g提升到71.39mg/g。之后采用500W微波誘變25s,使γ-聚谷氨酸產(chǎn)量由62.22mg/g提升至71.88mg/g。最后以各單因素的最佳條件為基礎(chǔ)進行復(fù)合誘變,將γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量由62.40mg/g提高至72.87mg/g。而總體而言,通過各誘變因素與培養(yǎng)基優(yōu)化,γ-聚谷氨酸總共提高了54.35%。運用苯酚-硫酸法測定了γ-聚谷氨酸發(fā)酵物中多糖的含量,得出了其含量及所占比例的變化趨勢,即隨著γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株的選育,多糖含量從81.2mg/g增加至87.3mg/g,增幅為7.5%。這一變化可能與菌株的誘變選育過程中生長代謝增強有關(guān),這一研究,為γ-聚谷氨酸在實際生產(chǎn)中的除雜、分離純化提供了參考,為γ-聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)物的成分及其含量的分析提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：γ-聚谷氨酸 高分子 生物相容性 誘變選育
【學位授予單位】：河南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 主要符號表13-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 γ-聚谷氨酸14-17
• 1.1.1 簡介14
• 1.1.2 主要性質(zhì)14-15
• 1.1.2.1 分子結(jié)構(gòu)14
• 1.1.2.2 物理化學性質(zhì)14-15
• 1.1.3 γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法15-16
• 1.1.4 γ-聚谷氨酸工程菌研究進展16-17
• 1.2 γ-聚谷氨酸定性定量分析方法17-18
• 1.2.1 γ-聚谷氨酸測定方法研究現(xiàn)狀17
• 1.2.2 差值法17-18
• 1.2.3 直接法18
• 1.2.4 γ-PGA--CTAB 復(fù)合物比濁法18
• 1.3 γ-聚谷氨酸菌株誘變育種18-19
• 1.3.1 物理誘變19
• 1.3.2 化學誘變19
• 1.3.3 誘變育種篩菌方法19
• 1.4 γ-聚谷氨酸發(fā)酵條件及發(fā)酵樣品研究19-20
• 1.4.1 固體發(fā)酵條件研究19-20
• 1.4.2 γ-聚谷氨酸產(chǎn)品純化及保存方法研究20
• 1.5 γ-聚谷氨酸應(yīng)用20-23
• 1.5.1 γ-聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用20-21
• 1.5.2 γ-聚谷氨酸在食品工業(yè)中的應(yīng)用21
• 1.5.3 γ-聚谷氨酸在水果保鮮中的應(yīng)用21
• 1.5.4 γ-聚谷氨酸在地質(zhì)研究及地震預(yù)測中的應(yīng)用21-23
• 1.6 本研究的目的和意義23-24
• 1.6.1 目的23
• 1.6.2 意義23-24
• 第二章 γ-聚谷氨酸測定方法研究24-34
• 2.1 材料與方法24-29
• 2.1.1 實驗材料24-26
• 2.1.2 差值法26
• 2.1.2.1 標準曲線的測定26
• 2.1.2.2 γ-聚谷氨酸含量的測定26
• 2.1.3 CTAB比濁法26-28
• 2.1.3.1 CTAB比濁法標準曲線的測定26-27
• 2.1.3.2 γ-聚谷氨酸含量的測定27-28
• 2.1.4 直接法28
• 2.1.4.1 吸光度與γ-聚谷氨酸標準曲線的測定28
• 2.1.4.2 γ-聚谷氨酸含量的測定28
• 2.1.5 直接稱重法28-29
• 2.2 結(jié)果與分析29-33
• 2.2.1 差值法測發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的檢測29
• 2.2.2 γ-PGA-CTAB復(fù)合物比濁法的測定結(jié)果29-31
• 2.2.3 直接法標準曲線的繪制31-32
• 2.2.4 粗品直接稱重法操作步驟32-33
• 2.3 討論33-34
• 第三章 以豆粕為主要原料生產(chǎn)γ-PG A發(fā)酵條件的優(yōu)化34-46
• 3.1 材料與方法35-38
• 3.1.1 實驗材料35
• 3.1.2 菌種的篩選、活化及發(fā)酵產(chǎn)物的定性35-36
• 3.1.3 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化36-38
• 3.1.3.1 碳源的選擇36-37
• 3.1.3.2 碳源添加比例的選擇37
• 3.1.3.3 氨基酸及氨基酸鹽對的γ-聚谷氨酸的影響37
• 3.1.3.4 無機鹽離子對γ-PGA產(chǎn)量的影響37
• 3.1.3.5 PH的選擇對γ-PGA產(chǎn)量的影響37
• 3.1.3.6 接種量對γ-PGA產(chǎn)量的影響37-38
• 3.1.3.7 固體發(fā)酵條件的正交試驗優(yōu)化38
• 3.2 結(jié)果與分析38-45
• 3.2.1 分離菌株特征結(jié)果分析38-39
• 3.2.2 γ-聚谷氨酸固體發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果分析39-45
• 3.2.2.1 碳源的選擇39-40
• 3.2.2.2 碳氮源比例的選擇40-41
• 3.2.2.3 氨基酸及氨基酸鹽的選擇41-42
• 3.2.2.4 添加無機鹽選擇42
• 3.2.2.5 pH的選擇42-43
• 3.2.2.6 接種量的選擇43
• 3.2.2.7 正交試驗優(yōu)化結(jié)果43-45
• 3.3 討論45-46
• 第四章 γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株的選育46-60
• 5.1 材料與方法47-50
• 5.1.1 實驗材料47
• 5.1.2 γ-聚谷氨酸菌種子生長曲線的測定47
• 5.1.3 菌懸液的制備47
• 5.1.4 紫外誘變47-48
• 5.1.5 初篩方法48
• 5.1.6 復(fù)篩方法48
• 5.1.7 DES誘變48-49
• 5.1.8 初篩方法49
• 5.1.9 復(fù)篩方法49
• 5.1.10復(fù)合誘變49
• 5.1.11初篩方法49
• 5.1.12復(fù)篩方法49
• 5.1.13 復(fù)合誘變49-50
• 5.1.14 初篩方法50
• 5.1.15 復(fù)篩方法50
• 5.2 結(jié)果與分析50-58
• 5.2.1 種子生長曲線的測定50
• 5.2.2 紫外誘變菌株致死率和正向突變率50-52
• 5.2.3 紫外誘變篩選菌株結(jié)果分析52
• 5.2.4 DES 誘變52-54
• 5.2.5 微波誘變54-57
• 5.2.6 復(fù)合誘變57
• 5.2.7 復(fù)篩出高產(chǎn)菌的傳代穩(wěn)定性研究57-58
• 5.3 討論58-60
• 第五章 γ-聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)物的成分分析60-63
• 4.1 材料與方法60-61
• 4.1.1 實驗材料60
• 4.1.2γ-聚谷氨酸發(fā)酵液的制備60-61
• 4.1.3 γ-聚谷氨酸發(fā)酵液中多糖的分析方法61
• 4.2 結(jié)果與分析61-62
• 4.2.1 苯酚硫酸法測多糖標準曲線的建立61-62
• 4.2.2 γ-聚谷氨酸發(fā)酵液結(jié)果分析62
• 4.3 討論62-63
• 第六章 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷、在學習期間的研究成果及發(fā)表的學術(shù)論文69

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