本文關(guān)鍵詞：還原-pH雙重響應(yīng)的PAMAM納米粒聯(lián)合攜載阿霉素與乳腺癌MDR逆轉(zhuǎn)劑依克立達的研究

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【摘要】：目的:基于聚酰胺-胺樹狀大分子(PAMAM),制備還原、pH雙重敏感的納米載體PSSP,用于聯(lián)合攜載化療藥物阿霉素(DOX)及耐藥逆轉(zhuǎn)劑依克立達(ELC),同時對其逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的效果進行體內(nèi)外評價。方法:本文采用氫譜(1H NMR)、紅外光譜(FTIR)對載體PSSP進行結(jié)構(gòu)表征。利用疏水作用同時負載DOX和ELC制備聯(lián)載藥納米粒PSSP/DOX/ELC,并對其進行粒徑、電位、包封率和載藥量的表征。通過透析袋法考察納米粒的體外釋放行為。以MCF-7(對DOX敏感)和MCF-7/ADR(對DOX不敏感)的人乳腺癌細胞為主要的模型細胞,通過MTT法分別測定空白載體、游離ELC、PSSP/DOX和PSSP/DOX/ELC納米粒的細胞毒性,計算相應(yīng)的IC50、耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)因子。通過激光共聚焦(CLSM)、流式細胞儀和酸化異丙醇萃取法對載藥納米粒的攝取情況進行定性及定量分析。選取代表性的抑制劑考察細胞攝取機制,并通過還原、酸抑制劑考察納米粒在細胞內(nèi)的釋藥情況。以P-gp的自然底物羅丹明123為模型藥,利用流式細胞術(shù)考察ELC在細胞內(nèi)的起效濃度以及對藥物外排的抑制效果。利用ATP檢測試劑盒及流式細胞術(shù)進一步考察ELC的作用機制。載藥納米粒的體內(nèi)抗腫瘤實驗在MCF-7荷瘤裸鼠的體內(nèi)進行的,并采用HE染色的方法考察腫瘤和主要器官的病理變化。結(jié)果:1H NMR和FTIR結(jié)果顯示,載體PSSP成功合成。制備的不同DOX:ELC摩爾比的納米粒粒徑在10~20 nm之間,Zeta電位在+2~5 mV之間。所制備的納米粒具有較高的包封率,同時負載兩藥時DOX載藥量在10%左右,ELC也可達到2%左右。PSSP/DOX/ELC納米粒中兩藥體外同時釋放呈現(xiàn)明顯的還原、pH敏感性�？瞻纵d體和游離ELC無明顯的細胞毒性。與PSSP/DOX相比,PSSP/DOX/ELC聯(lián)載納米粒表現(xiàn)出較強的細胞毒性和多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果,細胞攝取實驗結(jié)果同樣表明PSSP/DOX/ELC的攝取顯著高于PSSP/DOX,由此證明DOX與ELC聯(lián)用增加DOX的抗腫瘤活性。納米粒主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑進入細胞,在細胞中利用溶酶體的酸環(huán)境和胞質(zhì)的高還原環(huán)境釋藥。ELC可在低濃度條件下抑制P-gp對DOX的外排,增加胞內(nèi)含量,另一方面可能間接性引起胞內(nèi)ATP水平的升高,從而增加能量依賴性的載體攝取,進一步提高DOX的入胞量。體內(nèi)抑瘤實驗表明PSSP/DOX/ELC納米粒通過不同的給藥策略均能明顯抑制腫瘤生長,同時HE染色結(jié)果顯示PSSP/DOX/ELC可顯著降低DOX的毒副作用,此外PSSP/DOX/ELC還可有效遏制腫瘤耐藥轉(zhuǎn)變前期的藥物外排應(yīng)激反應(yīng),降低腫瘤治療的難度。結(jié)論:本文基于PAMAM成功制備了具有還原、pH雙敏感性的DOX和ELC聯(lián)載納米粒。所制備的納米粒粒徑均一,具有較高的包封率、載藥量,體外釋放呈現(xiàn)良好的還原、pH雙重敏感性。體內(nèi)外抗腫瘤活性實驗結(jié)果顯示,聯(lián)載納米�？捎行孓D(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥,增強DOX對腫瘤細胞的毒性,同時有效遏制一般腫瘤化療初期由耐藥轉(zhuǎn)變引起的藥物外排應(yīng)激反應(yīng),降低腫瘤治療的難度,減少毒副作用的發(fā)生。該抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)用于腫瘤治療具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：阿霉素 依克立達 多藥耐藥 PAMAM 還原-pH雙敏感
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96;R943
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 前言13-21
• 1. MDR逆轉(zhuǎn)及其應(yīng)對策略13-15
• 1.1 MDR產(chǎn)生機制13
• 1.2 P-糖蛋白13-14
• 1.3 MDR逆轉(zhuǎn)及其策略14-15
• 1.4 第三代P-gp抑制劑——依克利達15
• 2. 阿霉素與新型遞藥系統(tǒng)15-16
• 3. 聯(lián)合用藥與MDR逆轉(zhuǎn)研究進展16
• 4. 條件響應(yīng)性納米遞藥系統(tǒng)研究進展16-19
• 4.1 pH敏感型16-17
• 4.2 還原敏感型17
• 4.3 其他敏感型17-18
• 4.4 以聚酰胺-胺樹狀大分子為核心的納米遞藥系統(tǒng)18-19
• 5. 課題設(shè)計思路及意義19-21
• 第一章 載體PAMAM-S-S-PEG的合成及表征21-25
• 1 材料與儀器21
• 1.1 材料與試劑21
• 1.2 儀器21
• 2 實驗方法21-22
• 2.1 PAMAM-S-S-PEG的合成21-22
• 2.2 PAMAM-S-S-PEG的結(jié)構(gòu)驗證22
• 2.2.1 PAMAM-S-S-PEG的 1H-NMR核磁表征22
• 2.2.2 PAMAM-S-S-PEG的FTIR分析22
• 3 實驗結(jié)果22-24
• 3.1 PAMAM-S-S-PEG的 1H-NMR分析22-23
• 3.2 PAMAM-S-S-PEG的FTIR分析23-24
• 4 討論與小結(jié)24-25
• 第二章 納米粒PSSP/DOX/ELC的制備及表征25-35
• 1 材料與儀器25
• 1.1 材料與試劑25
• 1.2 儀器25
• 2 實驗方法25-28
• 2.1 DOX體外分析方法的建立25-26
• 2.1.1 DOX紫外吸收波長（λ max）的確定25-26
• 2.1.2 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制26
• 2.1.3 精密度、回收率試驗26
• 2.2 ELC體外分析方法的建立26-27
• 2.2.1 色譜條件的確定26
• 2.2.2 ELC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制26
• 2.2.3 精密度、回收率試驗26-27
• 2.3 聯(lián)載納米粒PSSP/DOX/ELC的制備27
• 2.4 聯(lián)載納米粒PSSP/DOX/ELC的表征27-28
• 2.4.1 載藥量、包封率測定27
• 2.4.2 粒徑、電位表征27
• 2.4.3 納米粒體外釋放考察27-28
• 3 實驗結(jié)果28-34
• 3.1 DOX體外分析方法的建立28-29
• 3.1.1 DOX紫外吸收波長（λ max）的確定28-29
• 3.1.2 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制29
• 3.1.3 精密度、回收率試驗29
• 3.2 ELC體外分析方法的建立29-30
• 3.2.1 HPLC方法專屬性及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制29-30
• 3.2.2 精密度、回收率試驗30
• 3.3 聯(lián)載納米粒PSSP/DOX/ELC的表征30-34
• 3.3.1 納米粒包封率、載藥量測定30-31
• 3.3.2 納米粒粒徑、電位測定31-32
• 3.3.3 納米粒體外釋放考察32-34
• 4 討論與小結(jié)34-35
• 第三章 納米粒PSSP/DOX/ELC體外抗腫瘤活性研究35-56
• 1 材料與儀器35-36
• 1.1 材料與試劑35
• 1.2 儀器35-36
• 2 實驗方法36-42
• 2.1 細胞培養(yǎng)36
• 2.2 ELC起效濃度考察36
• 2.3 細胞毒性實驗36-38
• 2.3.1 MTT實驗原理及基本操作36-37
• 2.3.2 空白載體及游離ELC細胞毒性實驗37
• 2.3.3 聯(lián)載納米粒細胞毒性實驗37-38
• 2.4 細胞攝取實驗38-39
• 2.4.1 共聚焦定性分析38
• 2.4.2 流式定量考察38
• 2.4.3 細胞內(nèi)DOX定量測定38-39
• 2.5 胞內(nèi)藥物遞送實驗39-40
• 2.5.1 攝取機制考察39
• 2.5.2 聯(lián)載納米粒細胞內(nèi)共定位實驗39
• 2.5.3 還原、酸敏感性考察39-40
• 2.6 ELC作用機制40-42
• 2.6.1 蓄積和外排實驗40
• 2.6.2 ELC促攝取作用機制考察40-42
• 2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計42
• 3 實驗結(jié)果42-54
• 3.1 ELC起效濃度考察42-43
• 3.2 細胞毒性實驗43-46
• 3.2.1 空白載體及游離ELC細胞毒性實驗43-44
• 3.2.2 聯(lián)載納米粒細胞毒性實驗44-46
• 3.3 細胞攝取實驗46-49
• 3.3.1 共聚焦定性分析46-47
• 3.3.2 流式定量分析47-48
• 3.3.3 細胞內(nèi)DOX定量測定48-49
• 3.4 胞內(nèi)藥物遞送實驗49-52
• 3.4.1 攝取機制考察49-50
• 3.4.2 細胞內(nèi)共定位實驗50-51
• 3.4.3 還原、酸敏感性考察51-52
• 3.5 ELC作用機制考察52-54
• 3.5.1 蓄積和外排實驗52-53
• 3.5.2 ELC作用機制假設(shè)及驗證53-54
• 4 討論與小結(jié)54-56
• 第四章 納米粒PSSP/DOX/ELC體內(nèi)抗腫瘤活性研究56-68
• 1 材料與儀器56
• 1.1 材料與試劑56
• 1.2 儀器56
• 1.3 動物56
• 2 實驗方法56-58
• 2.1 MCF-7 荷瘤裸鼠模型的建立56
• 2.2 荷瘤裸鼠活體熒光成像實驗56-57
• 2.3 體內(nèi)抗腫瘤活性研究57
• 2.4 腫瘤及各主要器官病理學(xué)觀察57
• 2.5 體內(nèi)預(yù)防和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究57-58
• 2.5.1 細胞膜表面P-gp表達與DOX誘導(dǎo)57-58
• 2.5.2 PSSP/DOX/ELC預(yù)防和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥58
• 3 實驗結(jié)果58-66
• 3.1 荷瘤裸鼠活體熒光成像實驗58-60
• 3.2 體內(nèi)抗腫瘤活性研究60-61
• 3.3 腫瘤及各主要器官病理學(xué)觀察61-63
• 3.4 體內(nèi)預(yù)防和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥轉(zhuǎn)變的研究63-66
• 3.4.1 細胞膜表面P-gp表達及DOX誘導(dǎo)63-64
• 3.4.2 PSSP/DOX/ELC預(yù)防和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥64-66
• 4 討論與小結(jié)66-68
• 全文總結(jié)68-70
• 后續(xù)工作與展望70-71
• 參考文獻71-80
• 攻讀碩士期間公開發(fā)表的論文80-81
• 縮略詞表81-83
• 致謝83-85

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