發(fā)布時間：2017-07-17 21:40

  本文關鍵詞：新型HIV非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和輔助受體抑制劑體外抗病毒活性研究

  更多相關文章： HIV非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 輔助受體抑制劑 HIV臨床分離株 體外抑制

【摘要】：研究背景人類免疫缺陷病毒(HIV)是目前國際研究中已知變異較快的病毒。我國在大規(guī)模開展高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)下,耐藥性的產(chǎn)生導致抗病毒治療失敗。因而有必要研發(fā)新型藥物,設計可以抑制耐藥病毒的藥物。目前抗HIV藥物分為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,蛋白水解酶抑制劑、融合抑制劑、輔助受體抑制劑和整合酶抑制劑等。大部分的新型藥物是基于這些藥物的設計對原有化合物進行不斷的改進。由于HIV的高度變異性,不同靶點、不同的設計的藥物對不同亞型的HIV抑制活性的敏感性是不同的,對于耐藥病毒株的抑制能力也各不相同。體外抑制活性的檢測是新型抑制劑對HIV抑制作用最直觀的評價指標,利用我國HIV主要流行株對藥物抑制活性檢測可以鑒定抑制活性的廣普性,為藥物后續(xù)開發(fā)和研究提供重要的參考依據(jù)。研究目的1.通過對HIV-1SF33、HIV-1BAL和HIV-1A17實驗室標準株體外抑制活性的檢測對新型HIV抑制劑進行初步評價和篩選,研究新型HIV抑制劑對我國HIV主要流行株的體外抑制活性；2.通過體外藥物壓力實驗探討新型HIV抑制劑耐藥機制。研究方法研究對象：本研究的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是由北京大學醫(yī)學部藥學院設計合成的11種尿嘧啶類化合物編號為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、 W23及W24；和12種吡啶酮類化合物編號為W12、W13、W14、W15、W16、W25、W26、W27、W40、W41、W42及W43。輔助受體抑制劑是由復旦大學基礎醫(yī)學院提供的2種CCR5輔助受體抑制劑XLLN-148-40和XLLN-148-42。分別選用實驗室標準病毒株和我國臨床分離HIV病毒在體外篩選這些抑制劑的抗病毒活性。實驗方法：1.HIV流行株的制備：全血用于檢測CD4+T細胞計數(shù),從全血中分離出的血漿用于病毒載量和病毒亞型的檢測。剩余PBMCs附集層使用梯度離心法得到PBMCs,與健康人的PBMCs共同培養(yǎng)得到病毒培養(yǎng)上清。病毒培養(yǎng)上清經(jīng)過再次感染健康人的PBMCs后培養(yǎng)、收集并進行P24抗原檢測及滴度測定,用于藥物抗HIV體外抑制活性的檢測。2.HIV抑制劑體外活性評價：將HIV抑制劑連續(xù)梯度稀釋后分別與TZM-B1、 PBMC和MT4三種細胞作用,通過活細胞染色檢測OD值計算出抑制劑的半數(shù)細胞致死濃度(CC50)。同樣將HIV抑制劑連續(xù)梯度稀釋后分別在TZM-B1、 PBMC和MT4三種細胞系上抑制等量且定量的HIV病毒,通過檢測細胞發(fā)光值或P24抗原含量連同對應的藥物濃度計算出該抑制劑的半數(shù)抑制濃度(EC50)。計算CC50/EC50從而得到藥物的選擇指數(shù)sI。3.HIV-1體外誘導耐藥：使用藥物抑制病毒在MT4細胞上的復制,連續(xù)培養(yǎng)14周時間并不斷增加藥物使用劑量,對最終得到的培養(yǎng)上清進行基因測序,得到發(fā)生突變的耐藥位點。4.感染性克隆病毒的制備：使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit對質(zhì)粒進行定點誘變。主要通過PCR法引入點突變,對之前得到的耐藥位點在感染性克隆上進行點突變后進行抑制劑抑制活性檢測,用于驗證耐藥突變的產(chǎn)生。研究結(jié)果1.11種尿嘧啶化合物對HIV-1SF33毒株的體外抑制活性EC50為0.002uM-2.071uM,選擇指數(shù)S150在39-38215之間；12種吡啶酮化合物對HIV-1SF33毒株的體外抑制活性EC50為0.003uM-0.103uM,選擇指數(shù)S150在386-28760之間。經(jīng)過HIV-1A17耐藥標準株的篩選,尿嘧啶化合物W6、W8、W9、W24及吡啶酮化合物W12、W25、W26、W42對其具有抑制活性,體外抑制活性EC50分別為0.091uM-2.543uM和0.090uM-2.755uM。選擇指數(shù)S1分別在48-1080之間和73-1068之間。其中化合物W6對HIV-1SF33毒株的體外抑制活性EC50達到了0.002uM。2.尿嘧啶化合物W6對我國HIV主要流行的CRF07 BC亞型抑制活性EC50為0.003uM-0.006uM,對B’亞型抑制活性EC50為0.001uM-0.004uM,對CRF01 AE亞型抑制活性EC50為0.001uM-0.006uM,選擇指數(shù)S150分別在12735-40933、18021-76410和22967-76410之間。3.使用化合物W6抑制HIV-1SF33在MT4上的復制。連續(xù)培養(yǎng)14周并不斷增加化合物使用劑量,最終的培養(yǎng)上清經(jīng)過基因測序和比對得到耐藥突變位點Y188L和V106I。4.通過構(gòu)建分別含有耐藥突變位點Y188L和V106I克隆病毒后在次進行體外抑制活性檢測,確認了具有Y188L和V106I突變位點的感染性克隆使化合物W6的抑制活性下降。5.CCR5輔助受體抑制劑XLLN-148-40、XLLN-148-42對HIV-1SF33雙嗜性實驗室標準株和HIV-1BALCCR5單嗜性標準株及HIV-1A17非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶耐藥的標準株抑制活性EC50分別為0.871uM、14.959um、8.641um、0.006uM、0.059uM和0.078uM,選擇指數(shù)S150分別為66.8、1148.1、115.7、16949.2、16666.7和35714.3。XLLN-148-40對我國HIV主要流行的CRF07_BC亞型抑制活性EC50為0.898uM-12.246uM,對B’亞型抑制活性EC50為2.368uM-47.052uM,對CRF01_AE亞型抑制活性EC50為0.362uM-163.137uM,抑選擇指數(shù)S150在6.1-5181.3之間,XLLN-148-42對我國HIV主要流行的CRF07_BC亞型抑制活性EC50為0.003uM-0.527uM,對B’亞型抑制活性EC50為0.0002uM-0.602uM,對CRF01_AE亞型抑制活性EC50為0.031uM-0.793uM,選擇指數(shù)S150在1661-5000000之間。研究結(jié)論本研究中的尿嘧啶化合物、吡啶酮化合物以及CCR5輔助受體抑制劑對HIV-1SF33雙嗜性實驗室標準株均有不同程度的抑制活性�；衔颳6在尿嘧啶化合物組中抑制活性最強；W42是吡啶酮化合物組中同時對實驗室標準株和耐藥標準株同時具有極強抑制活性的化合物�；衔颳6對我國HIV主要流行株具有廣泛的抑制作用,但在長期使用后仍會出現(xiàn)以Y188L和V1061突變?yōu)橹鞯哪退�。CCR5輔助受體抑制劑XLLN-148-40、XLLN-148-42對HIV-1SF33雙嗜性實驗室標準株、HIV-1BALCCR5單嗜性標準株和HIV-1A17耐藥標準株以及我國HIV主要流行株均具有不同程度的抑制作用,化合物XLLN-148-42的抑制活性明顯高于化合物XLLN-148-40。
【關鍵詞】：HIV非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 輔助受體抑制劑 HIV臨床分離株 體外抑制
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文縮略詞表14-15
• 前言15-22
• 材料和方法22-41
• 結(jié)果41-55
• 討論55-61
• 總結(jié)61-62
• 參考文獻62-67
• 個人基本情況67-68
• 碩士期間文章發(fā)表情況68-69
• 致謝69-70
• 發(fā)表文章70-76

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 成軍;;脾切除治療人類免疫缺陷病毒(HIV)伴發(fā)的免疫性血小板減少性紫癜[J];寧夏醫(yī)學雜志;1989年05期

2 Pascal A;陳金華;;評價人類免疫缺陷病毒(HIV)流行的經(jīng)濟影響的理論問題[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生經(jīng)濟分冊);1990年02期

3 王莉,曾俊,岳蕤,邊海燕,周妮;HIV病毒對手術(shù)麻醉科人員的威脅及防范[J];局解手術(shù)學雜志;2003年04期

4 蘇慧勇,楊學文,蘇健康,周俊,尹光芝,姚正林;人類免疫缺陷病毒(HIV)感染合并肺結(jié)核34例臨床分析[J];中國防癆雜志;2004年01期

5 王傳銘,李濤洪,潘蓄林,張旭東;氨基糖苷類抗生素的抗HIV潛力[J];生命的化學;2005年03期

6 薛云;;抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可預防HIV母乳傳播[J];國外醫(yī)學情報;2006年11期

7 李陽;;不同人群艾滋病病毒(HIV)自愿性咨詢和檢測的需求分析[J];中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學專業(yè)半月刊);2008年22期

8 徐楷;許文博;張明元;柳建發(fā);;HIV及艾滋病防治研究進展[J];地方病通報;2008年02期

9 喬瑞娟;張晨華;許丹;石林;李旭;王一理;;感染HIV兒童抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療時機的初步探討[J];西北大學學報(自然科學版);2010年04期

10 譚健;;嬰兒如何將HIV傳染給母親[J];國外醫(yī)學情報;1989年22期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄭素華;端木宏謹;李拯民;馮惠忠;張福杰;崔為國;余為業(yè);朱林;譚愛軍;陳明朝;;人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者中結(jié)核菌素試驗反應的研究(摘要)[A];中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會2002年學術(shù)會議論文匯編[C];2002年

2 王佑春;;HIV假病毒體系在病毒特性研究和檢測中的應用[A];2012全國臨床微生物與感染免疫學術(shù)研討會論文集[C];2012年

3 單平囡;盧志勇;;HIV主動檢測在創(chuàng)傷性病人的必要性分析[A];2007年浙江省醫(yī)學檢驗學學術(shù)年會論文匯編[C];2007年

4 張昕;梁權(quán);王縵;;HIV-2 gp36重組抗原的制備及其在HIV診斷中的應用[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

5 王曉艷;劉兆梅;王小利;馬洪濤;楊怡姝;溫瑞興;;天然產(chǎn)物中HIV三大酶類抑制劑的研究進展[A];中華中醫(yī)藥學會防治艾滋病學術(shù)研討會暨2006年年會論文集[C];2006年

6 王克榮;徐克沂;屈文妍;李秀蘭;楊翌;;中原地區(qū)有償獻血人員HIV家庭內(nèi)感染狀況分析[A];全國傳染病護理學術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2004年

7 劉盛元;王福祥;;黑龍江省羈押人群HIV分子流行病學研究[A];中華醫(yī)學會第四次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學術(shù)會議論文匯編[C];2009年

8 陳亞崗;;HIV的職業(yè)暴露與防范[A];2006年浙江省感染病、肝病學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 趙紅心;;如何調(diào)整抗HIV治療方案[A];中華醫(yī)學會第五次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

10 柏凌;余秋蓉;李秀梅;張振平;;HIV—1 Tat蛋白對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞屏障功能的影響及其分子機制研究[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術(shù)大會論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 李懷巖 王家全;當警察遇上HIV:“無計可施”的尷尬如何解[N];新華每日電訊;2013年

2 記者 劉莉;我國加入國際“邁向HIV治愈計劃”[N];科技日報;2012年

3 翻譯 李勇;HIV藥物或迎“重磅炸彈”時代[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2013年

4 鄭煥斌;23%的南非軍人感染HIV[N];科技日報;2004年

5 王迪;HIV藥物市場的遠大前程[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

6 深檢;深圳：HIV升溫[N];中國國門時報(中國出入境檢驗疫報);2001年

7 郭文;治療HIV/肝炎合并感染誰主沉浮？[N];中國醫(yī)藥報;2005年

8 任河;“基因休眠法”控制HIV擴散[N];中國醫(yī)藥報;2004年

9 ;抗HIV能力 基因說了算？[N];中國醫(yī)藥報;2004年

10 國斌;捕捉HIV侵襲細胞全過程[N];健康報;2000年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 劉慧鑫;高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療對單陽家庭配偶間HIV性傳播預防作用研究[D];中國疾病預防控制中心;2015年

2 金洪濤;HIV多表位重組疫苗的構(gòu)建及其實驗免疫研究[D];吉林大學;2007年

3 毛魏魏;新型香豆素類衍生物的合成及其抗乳腺癌、抗HIV的活性研究[D];華南理工大學;2010年

4 耿文清;外周血DC在控制和傳播HIV感染中的作用研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

5 申鎮(zhèn)維;新型HIV多表位重組疫苗的構(gòu)建、純化及其實驗免疫研究[D];吉林大學;2009年

6 李琳;酸酐修飾卵清蛋白作為候選殺微生物劑預防HIV性傳播研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

7 郝彥哲;慢病毒介導siRNA和細胞內(nèi)抗病毒因子對HIV抑制作用研究[D];北京工業(yè)大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曹碧云;抗HIV化合物SJP-L-5的結(jié)構(gòu)改造與活性研究[D];云南大學;2016年

2 徐維四;新型HIV非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和輔助受體抑制劑體外抗病毒活性研究[D];中國疾病預防控制中心;2016年

3 臧玉翠;復方大青葉注射液對HIV侵入和復制的作用[D];鄭州大學;2011年

4 李樂濤;海洋天然產(chǎn)物抗HIV作用機制和作用特點的研究及影響核糖核酸酶H活性的物質(zhì)與抗HIV藥物聯(lián)合使用體外藥效學研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

5 楊光;HIV專管強戒場所處突研究[D];吉林大學;2015年

6 王潔;抗HIV香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)改造及生物活性研究[D];復旦大學;2010年

7 阮元;中國境內(nèi)406名緬甸吸毒者跨境現(xiàn)狀及感染或傳播HIV高危因素的研究[D];昆明醫(yī)學院;2011年

8 年進興;中藥毛冬青抗HIV活性成分研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2005年

9 楊林;核苷磷�；悸�(lián)殼聚糖的抗HIV高分子前藥合成及納米化方法的研究[D];北京化工大學;2010年

10 梁君;限制性抗原親和力方法（LAg-avidity EIA）應用于我國哨點HIV新發(fā)感染檢測的研究[D];中國疾病預防控制中心;2014年

，

本文編號：554711