本文關(guān)鍵詞：HIV-1假病毒篩選藥物體系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究

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【摘要】：[目的]建立并優(yōu)化VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒篩選抗HIV-1藥物體系,對(duì)初篩活性好的化合物進(jìn)行體外抗HIV-1活性研究。[方法]采用Promega公司的熒光素酶活性分析系統(tǒng),比較了VSVG/HIV-1NL4-3Luc對(duì)4種不同細(xì)胞的感染力。采用3種不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)不同類(lèi)型HIV-1上市藥物進(jìn)行活性評(píng)價(jià),進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性與有效性。隨后,應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)特定靶點(diǎn)化合物進(jìn)行篩選,并與HIV-1ⅢB病毒篩選體系所得結(jié)果進(jìn)行比較。最后,對(duì)該系統(tǒng)篩選的活性較好的樣品采用MTT法檢測(cè)了化合物對(duì)不同細(xì)胞株的毒性作用,用ELISA測(cè)p24的方法進(jìn)行不同病毒株的藥效評(píng)價(jià)。[結(jié)果]VSVG/HIV-1NL4-3 Luc對(duì)CRFK細(xì)胞的感染力最強(qiáng),報(bào)告基因的表達(dá)水平與加入的病毒量呈劑量依賴(lài)關(guān)系。比較3種不同實(shí)驗(yàn)條件下不同陽(yáng)性藥物抑制VSVG/HIV-1NL4-3 Luc的EC50,發(fā)現(xiàn)方法3條件最優(yōu)。而用該方法對(duì)化合物進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)其EC50與病毒HIV-1ⅢB所得EC50基本一致。對(duì)幾個(gè)抗病毒活性較高的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：DY1108、DY1118、DY1203和DY1204對(duì)C8166、MT-4、H9及PBMC細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性,CC50均200μg/ml;DY1119、DY1208和DY1209具有廣譜的抗HIV-1活性,對(duì)實(shí)驗(yàn)株(HIV-1ⅢB)、耐藥株(NRTI耐藥株HIV-174V、PI耐藥株HIV-1RF/V82F/184V、FI耐藥株HIV-1NL4-3 gp41 (36G) N42S)和臨床株(HIV-1KM018、HIV-1TC-1、HIV-1Wan)的復(fù)制均具有很強(qiáng)的抑制作用,ECso均在納克每毫升水平,而NNRTI耐藥株(HIV-1A17)對(duì)這些化合物表現(xiàn)出不同程度的耐藥；其余化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)株、耐藥株和臨床株也表現(xiàn)出較好的抑制效果；DY1119、DY1208和DY1209對(duì)HIV-1重組逆轉(zhuǎn)錄酶有較好地抑制作用,IC50分別為0.496μg/ml、0.038μg/ml、0.060μg/ml,其余抑制作用較弱。[結(jié)論]本研究成功建立并優(yōu)化了基于VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒的抗HIV藥物篩選體系,該平臺(tái)可進(jìn)行NNRTI、NRTI和INI的篩選,不適用于PI和FI的篩選。此假病毒模型的建立節(jié)省了人力、物力和財(cái)力,我們?cè)?級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選和抗HIV-I活性評(píng)價(jià)。對(duì)化合物的抗HIV-1活性研究表明,DY1119、DY1208IDY1209對(duì)不同病毒株有很強(qiáng)的體外抗HIV-1活性,我們希望能給致力于研發(fā)抗HIV-1藥物的研究者提供抗病毒活性的參考,促進(jìn)抗HIV-1藥物的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1假病毒 藥物篩選 優(yōu)化 應(yīng)用 抗HIV-1活性
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96;R943
【目錄】：

• 中英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-19
• 1 HIV-1病毒12-16
• 2 HIV-1假病毒16-18
• 3 本研究的思路、方法和意義18-19
• 材料與方法19-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 1.1 試劑19
• 1.2 溶液19-21
• 1.3 細(xì)胞21-22
• 1.4 病毒22
• 1.5 菌株22
• 1.6 質(zhì)粒22-23
• 1.7 待測(cè)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥物23
• 1.8 主要儀器及設(shè)備23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-35
• 2.1 假病毒篩選藥物體系的條件優(yōu)化及應(yīng)用23-28
• 2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存23-24
• 2.1.2 DH5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備24
• 2.1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞24-25
• 2.1.4 質(zhì)粒的制備25-26
• 2.1.5 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的包裝26
• 2.1.6 細(xì)胞系的選擇26
• 2.1.7 熒光素酶活性分析26
• 2.1.8 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc感染性檢測(cè)26-27
• 2.1.9 3種實(shí)驗(yàn)條件下陽(yáng)性藥物的檢測(cè)27-28
• 2.1.10 化合物篩選28
• 2.2 抗HIV-1活性研究28-33
• 2.2.1 病毒滴度的測(cè)定28-29
• 2.2.2 HIV-1實(shí)驗(yàn)株和耐藥株培養(yǎng)29
• 2.2.3 HIV-1臨床分離病毒株培養(yǎng)29
• 2.2.4 PBMC的分離和培養(yǎng)29-30
• 2.2.5 捕捉p24抗原ELISA方法測(cè)定HIV-1的復(fù)制30
• 2.2.6 化合物對(duì)人淋巴細(xì)胞系的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.7 化合物對(duì)人PBMC細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)31
• 2.2.8 化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)株HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166和MT-4細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制試驗(yàn)31
• 2.2.9 化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)株HIV-1_(ⅢB)急性感染H9細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制試驗(yàn)31-32
• 2.2.10 化合物對(duì)耐藥株急性感染C8166細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制試驗(yàn)32
• 2.2.11 化合物對(duì)臨床分離株HIV-1_(KM018)、HIV-1_(TC-1)和HIV-1_(Wan)在PBMC中復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.2.12 化合物對(duì)重組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)33
• 2.3 計(jì)算公式33-35
• 結(jié)果35-55
• 1 假病毒篩選藥物體系的條件優(yōu)化35-39
• 1.1 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc可高效感染CRFK細(xì)胞35
• 1.2 CRFK中Luc表達(dá)水平與病毒接種量呈劑量依賴(lài)關(guān)系35-36
• 1.3 3 種不同實(shí)驗(yàn)條件下陽(yáng)性藥物對(duì)VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的抑制作用36-37
• 1.4 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc篩選不同類(lèi)型化合物37-39
• 2 抗HIV-1活性研究39-55
• 2.1 化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用39-44
• 2.2 化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)株HIV-1_(ⅢB)的抑制作用44-48
• 2.2.1 化合物對(duì)HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)45-46
• 2.2.2 化合物對(duì)HIV-1_(ⅢB)急性感染MT-4細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)46-47
• 2.2.3 化合物對(duì)HIV-1_(ⅢB)急性感染H9細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)47-48
• 2.3 化合物對(duì)HIV-1耐藥株的抑制作用48-51
• 2.4 化合物對(duì)HIV-1臨床分離病毒株的抑制作用51-53
• 2.5 化合物對(duì)體外重組的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用53-55
• 討論55-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 綜述64-78
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果78-79
• 致謝79-81
• 附錄81-85

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本文編號(hào)：533662