本文關鍵詞：HIV-1假病毒篩選藥物體系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究

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【摘要】：[目的]建立并優(yōu)化VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒篩選抗HIV-1藥物體系,對初篩活性好的化合物進行體外抗HIV-1活性研究。[方法]采用Promega公司的熒光素酶活性分析系統(tǒng),比較了VSVG/HIV-1NL4-3Luc對4種不同細胞的感染力。采用3種不同實驗條件對不同類型HIV-1上市藥物進行活性評價,進一步驗證了該模型的可行性與有效性。隨后,應用該系統(tǒng)對特定靶點化合物進行篩選,并與HIV-1ⅢB病毒篩選體系所得結果進行比較。最后,對該系統(tǒng)篩選的活性較好的樣品采用MTT法檢測了化合物對不同細胞株的毒性作用,用ELISA測p24的方法進行不同病毒株的藥效評價。[結果]VSVG/HIV-1NL4-3 Luc對CRFK細胞的感染力最強,報告基因的表達水平與加入的病毒量呈劑量依賴關系。比較3種不同實驗條件下不同陽性藥物抑制VSVG/HIV-1NL4-3 Luc的EC50,發(fā)現(xiàn)方法3條件最優(yōu)。而用該方法對化合物進行篩選,發(fā)現(xiàn)其EC50與病毒HIV-1ⅢB所得EC50基本一致。對幾個抗病毒活性較高的化合物進行進一步的研究發(fā)現(xiàn)：DY1108、DY1118、DY1203和DY1204對C8166、MT-4、H9及PBMC細胞無明顯細胞毒性,CC50均200μg/ml;DY1119、DY1208和DY1209具有廣譜的抗HIV-1活性,對實驗株(HIV-1ⅢB)、耐藥株(NRTI耐藥株HIV-174V、PI耐藥株HIV-1RF/V82F/184V、FI耐藥株HIV-1NL4-3 gp41 (36G) N42S)和臨床株(HIV-1KM018、HIV-1TC-1、HIV-1Wan)的復制均具有很強的抑制作用,ECso均在納克每毫升水平,而NNRTI耐藥株(HIV-1A17)對這些化合物表現(xiàn)出不同程度的耐藥；其余化合物對實驗株、耐藥株和臨床株也表現(xiàn)出較好的抑制效果；DY1119、DY1208和DY1209對HIV-1重組逆轉錄酶有較好地抑制作用,IC50分別為0.496μg/ml、0.038μg/ml、0.060μg/ml,其余抑制作用較弱。[結論]本研究成功建立并優(yōu)化了基于VSVG/HIV-1NL4-3 Luc假病毒的抗HIV藥物篩選體系,該平臺可進行NNRTI、NRTI和INI的篩選,不適用于PI和FI的篩選。此假病毒模型的建立節(jié)省了人力、物力和財力,我們在2級生物安全實驗室即可進行大規(guī)模的藥物篩選和抗HIV-I活性評價。對化合物的抗HIV-1活性研究表明,DY1119、DY1208IDY1209對不同病毒株有很強的體外抗HIV-1活性,我們希望能給致力于研發(fā)抗HIV-1藥物的研究者提供抗病毒活性的參考,促進抗HIV-1藥物的發(fā)展。
【關鍵詞】：HIV-1假病毒 藥物篩選 優(yōu)化 應用 抗HIV-1活性
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96;R943
【目錄】：

• 中英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-19
• 1 HIV-1病毒12-16
• 2 HIV-1假病毒16-18
• 3 本研究的思路、方法和意義18-19
• 材料與方法19-35
• 1 實驗材料19-23
• 1.1 試劑19
• 1.2 溶液19-21
• 1.3 細胞21-22
• 1.4 病毒22
• 1.5 菌株22
• 1.6 質粒22-23
• 1.7 待測化合物和陽性對照藥物23
• 1.8 主要儀器及設備23
• 2 實驗方法23-35
• 2.1 假病毒篩選藥物體系的條件優(yōu)化及應用23-28
• 2.1.1 細胞的復蘇與凍存23-24
• 2.1.2 DH5α超級感受態(tài)細胞制備24
• 2.1.3 質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞24-25
• 2.1.4 質粒的制備25-26
• 2.1.5 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的包裝26
• 2.1.6 細胞系的選擇26
• 2.1.7 熒光素酶活性分析26
• 2.1.8 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc感染性檢測26-27
• 2.1.9 3種實驗條件下陽性藥物的檢測27-28
• 2.1.10 化合物篩選28
• 2.2 抗HIV-1活性研究28-33
• 2.2.1 病毒滴度的測定28-29
• 2.2.2 HIV-1實驗株和耐藥株培養(yǎng)29
• 2.2.3 HIV-1臨床分離病毒株培養(yǎng)29
• 2.2.4 PBMC的分離和培養(yǎng)29-30
• 2.2.5 捕捉p24抗原ELISA方法測定HIV-1的復制30
• 2.2.6 化合物對人淋巴細胞系的細胞毒性實驗30-31
• 2.2.7 化合物對人PBMC細胞毒性實驗31
• 2.2.8 化合物對實驗株HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166和MT-4細胞中病毒復制的抑制試驗31
• 2.2.9 化合物對實驗株HIV-1_(ⅢB)急性感染H9細胞中病毒復制的抑制試驗31-32
• 2.2.10 化合物對耐藥株急性感染C8166細胞中病毒復制的抑制試驗32
• 2.2.11 化合物對臨床分離株HIV-1_(KM018)、HIV-1_(TC-1)和HIV-1_(Wan)在PBMC中復制的抑制實驗32-33
• 2.2.12 化合物對重組HIV-1逆轉錄酶活性的抑制實驗33
• 2.3 計算公式33-35
• 結果35-55
• 1 假病毒篩選藥物體系的條件優(yōu)化35-39
• 1.1 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc可高效感染CRFK細胞35
• 1.2 CRFK中Luc表達水平與病毒接種量呈劑量依賴關系35-36
• 1.3 3 種不同實驗條件下陽性藥物對VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc的抑制作用36-37
• 1.4 VSVG/HIV-1_(NL4-3) Luc篩選不同類型化合物37-39
• 2 抗HIV-1活性研究39-55
• 2.1 化合物對細胞的毒性作用39-44
• 2.2 化合物對實驗株HIV-1_(ⅢB)的抑制作用44-48
• 2.2.1 化合物對HIV-1_(ⅢB)急性感染C8166細胞的抑制實驗45-46
• 2.2.2 化合物對HIV-1_(ⅢB)急性感染MT-4細胞的抑制實驗46-47
• 2.2.3 化合物對HIV-1_(ⅢB)急性感染H9細胞的抑制實驗47-48
• 2.3 化合物對HIV-1耐藥株的抑制作用48-51
• 2.4 化合物對HIV-1臨床分離病毒株的抑制作用51-53
• 2.5 化合物對體外重組的HIV-1逆轉錄酶活性的抑制作用53-55
• 討論55-58
• 結論58-59
• 參考文獻59-64
• 綜述64-78
• 參考文獻73-78
• 攻讀學位期間獲得的學術成果78-79
• 致謝79-81
• 附錄81-85

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本文編號：533662