本文關(guān)鍵詞：抗CD20抗體在CHO細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一.慢病毒載體對抗CD20抗體2F2表達(dá)的研究慢病毒(Lentivirus)載體區(qū)別于一般地逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在于,它不僅能感染分裂細(xì)胞,同時(shí)對非分裂細(xì)胞也具有很強(qiáng)的感染能力,它是以人類免疫缺陷型病毒HIV-1為基礎(chǔ),進(jìn)而改造發(fā)展而成的基因表達(dá)載體。在宿主體內(nèi),慢病毒載體將病毒RNA做為模板,合成雙鏈DNA,此后通過環(huán)化等一系列反應(yīng)下,結(jié)合病毒整合酶的催化,有效地整合進(jìn)入到宿主的染色體中,具有遺傳特性隨著基因組的分裂進(jìn)而分離,故可以實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。并且它的感染效率更高,可以容納大片段外源基因,生物安全性良好。慢病毒以單拷貝的形式將外源基因有效地整合到宿主的染色體中,因此避免了克隆載體重復(fù)多拷貝而引起地基因沉默等現(xiàn)象,并且根據(jù)篩選基因的不同,可選用其他篩選方式,避免了使用抗生素篩選引起地長期選擇過程中的目的基因的丟失,縮短了時(shí)間降低了成本。不僅如此,通過包裝得到的假病毒顆粒還可以進(jìn)行反復(fù)感染的操作,以增加進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體中的外源基因的數(shù)目。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試采用慢病毒載體過表達(dá)抗CD20抗體2F2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明初次感染慢病毒載體后,ELISA檢測O0450值時(shí)大多為假陽性的細(xì)胞株,最高值只有0.149,通過反復(fù)感染假病毒后,不僅大幅度的提高了感染效率,減少了假陽性概率,而且ELISA檢測OD450值最高可達(dá)0.521。由此,我們得出結(jié)論：利用慢病毒載體過表達(dá)抗CD20抗體2F2,利用假病毒顆粒反復(fù)感染CHO細(xì)胞,可在一定程度上提高抗CD20抗體2F2在CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。二.探索應(yīng)用高通量分選技術(shù)對提高抗CD20抗體表達(dá)量的影響因?yàn)榇嬖凇拔恢眯?yīng)”和目的基因整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中拷貝數(shù)的不同,外源基因整合入宿主細(xì)胞的基因組后,各個(gè)細(xì)胞株之間的表達(dá)水平存在著顯著的差異。有研究表明,在整個(gè)混合克隆中僅有少于1%的高表達(dá)的細(xì)胞克隆株,因此要從上萬各細(xì)胞中挑選出符合要求的高表達(dá)細(xì)胞株,工作量繁雜且結(jié)果不理想。熒光激活細(xì)胞分選器,又稱為流式細(xì)胞分選儀(flow cytometer, FCM),它是一臺集光電測量技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和電子生物技術(shù)為一體的先進(jìn)檢測儀,每秒可分析上萬細(xì)胞,能夠快速地檢測細(xì)胞的體積、DNA水平、RNA水平、蛋白質(zhì)表達(dá)等化學(xué)和物理性質(zhì),并且可對需要的細(xì)胞株進(jìn)行分析分選,具有多指標(biāo)測量、快速檢測、多數(shù)據(jù)大量采集、可對需要的生物顆�；蚣�(xì)胞株分選等特點(diǎn)。依據(jù)每個(gè)細(xì)胞的熒光特征和光散射,流式細(xì)胞分選儀從細(xì)胞群眾將特定的細(xì)胞快速分離出來。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路是通過分析細(xì)胞內(nèi)報(bào)告蛋白(GFP)表達(dá)水平,進(jìn)而間接分析抗CD20抗體2F2表達(dá)量的策略。綠色熒光蛋白(GFP)是一類重要的報(bào)告基因,不需要其它酶、底物或輔因子的參與即可自然發(fā)光,是一種從水母中分離出來的天然熒光蛋白質(zhì)。利用雙順反子載體將報(bào)告基因與抗CD20抗體體基因共表達(dá),再采用流式細(xì)胞分選儀檢測熒光強(qiáng)度,分選高表達(dá)報(bào)告基因的細(xì)胞株,從而獲得陽性克隆的目的細(xì)胞。結(jié)果顯示,利用流式細(xì)胞分選得到的陽性細(xì)胞群,再單克隆化操作后ELISA同步檢測,OD450最大值為0.819,將傳統(tǒng)的有限稀釋法作為對照組,對照組O0450最大值僅為0.679,因此,我們得出結(jié)論,應(yīng)用流式細(xì)胞分選的方法可以提高抗體表達(dá)量。三.控制輕重鏈比例對CHO細(xì)胞表達(dá)抗CD20抗體的影響眾所周知,抗體是由四條多肽鏈構(gòu)成的對稱結(jié)構(gòu),重鏈(H鏈)是其中兩條相對分子量較大且較長的相同多肽鏈；而輕鏈(L鏈)則是兩條相對分子量較小且較短的相同多肽鏈�？贵w重鏈結(jié)合蛋白(BiP)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與抗體輕鏈多肽短暫的結(jié)合后,輕鏈可以聚合二聚體的形式分泌到細(xì)胞胞外。與抗體輕鏈組裝成四聚體前,抗體重鏈多肽將與BiP持續(xù)保持結(jié)合狀態(tài),并且在缺乏抗體輕鏈多肽的前提下,重鏈最終將無法分泌到細(xì)胞胞外,細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體會降解無法分泌到細(xì)胞胞外的重鏈多肽,這樣就降低了全抗體的單位生產(chǎn)率。因此,有學(xué)者認(rèn)為過量的輕鏈多肽對于提高抗體表達(dá)量是至關(guān)重要的。然而傳統(tǒng)的抗體制備過程中,人們將抗體輕重鏈基因分別克隆在兩個(gè)相同的質(zhì)粒載體上,表達(dá)抗體蛋白,然而這種方法存在著輕重鏈比例不可控等缺點(diǎn)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)將輕重鏈基因克隆至實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的高表達(dá)載體GC-rich載體上,通過轉(zhuǎn)染G418篩選三周后,利用有限稀釋法隨機(jī)克隆,同時(shí)將共轉(zhuǎn)染的載體作為對照組,與對照組進(jìn)行同步比較,結(jié)果顯示ELISA同步檢測,使用IRES挑取的克隆陽性率為67.7%(65/96),OD450最大值為0.835；雖然對照組的克隆陽性率大致相同為70.8%(68/96),但ELISA同步檢測,OD450最大值為0.679；且利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)調(diào)控輕重鏈比例所得到的陽性克隆的OD450普遍高于對照組。由此,我們得到以下結(jié)論：控制輕重鏈比例在可提高抗CD20抗體2F2在CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
【關(guān)鍵詞】：哺乳動物細(xì)胞 抗體 慢病毒 高通量分選 雙順反子
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R917
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞表12-16
• 第一章 緒論16-23
• 1 單克隆抗體16-18
• 2 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)18-19
• 3 慢病毒載體對于抗CD20抗體2F2的研究19-20
• 4 高通量分選技術(shù)對抗CD20抗體表達(dá)量的研究20
• 5 輕重鏈基因比率在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用20-22
• 6 本研究主要創(chuàng)新點(diǎn)22-23
• 第二章 慢病毒載體對全人源抗CD20抗體2F2的研究23-40
• 2.1 前言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及基本操作23-32
• 2.2.1 材料與試劑23-24
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞24
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 2.2.4 相關(guān)溶液的配制25-29
• 2.2.5 基本操作29-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)步驟和方法32-34
• 2.3.1 慢病毒載體的構(gòu)建32-33
• 2.3.2 慢病毒載體的包裝33
• 2.3.3 經(jīng)包裝的慢病毒顆粒感染CHO靶細(xì)胞33-34
• 2.3.4 病毒顆粒二次、三次、四次感染CHO靶細(xì)胞34
• 2.3.5 穩(wěn)定單克隆細(xì)胞株的篩選34
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 2.4.1 慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建34-36
• 2.4.2 經(jīng)包裝的慢病毒顆粒感染CHO細(xì)胞36
• 2.4.3 慢病毒顆粒多次感染CHO細(xì)胞結(jié)果比較36-37
• 2.4.4 克隆篩選37-38
• 2.5 討論38-40
• 第三章 應(yīng)用高通量分選方法篩選表達(dá)抗CD20抗體細(xì)胞株40-63
• 3.1 前言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑40-42
• 3.2.1 細(xì)胞和試劑40
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器40-41
• 3.2.3 相關(guān)溶液配制41
• 3.2.4 基礎(chǔ)操作41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-52
• 3.3.0 重組表達(dá)質(zhì)粒p-H-IRES-YFP和p-L-IRES-GFP的構(gòu)建42-48
• 3.3.1 高表達(dá)載體pMH3-H-IRES-YFP和pMH3-L-IRES-GFP的構(gòu)建48-51
• 3.3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及二次轉(zhuǎn)染51
• 3.3.3 藥物篩選及流式細(xì)胞分選51-52
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-62
• 3.4.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建52-55
• 3.4.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及脂質(zhì)體二次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)55-57
• 3.4.3 G418篩選實(shí)驗(yàn)57-58
• 3.4.4 流式細(xì)胞儀分選實(shí)驗(yàn)58-59
• 3.4.5 單克隆篩選實(shí)驗(yàn)59-60
• 3.4.6 FACS~((+))及FACS~((-))結(jié)果比較60-61
• 3.4.7 抗CD20抗體2F2的表達(dá)與純化61-62
• 3.5 討論62-63
• 第四章 抗體輕重鏈比應(yīng)用于提高CHO細(xì)胞表達(dá)全人源化抗CD20抗體2F2的研究63-73
• 4.1 前言63-64
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料及基本操作64
• 4.2.1 材料與試劑64
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞64
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器64
• 4.2.4 相關(guān)溶液的配制64
• 4.2.5 基本操作64
• 4.3 實(shí)驗(yàn)步驟與方法64-67
• 4.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒p-L-IRES-H的構(gòu)建64-66
• 4.3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞66-67
• 4.3.3 藥物篩選及穩(wěn)定單克隆株挑取67
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-71
• 4.4.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建67-69
• 4.4.2 單克隆篩選實(shí)驗(yàn)69-70
• 4.4.4 IRES~((-))真核表達(dá)載體與IRES~((+))真核表達(dá)載體的比較70-71
• 4.5 討論71-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 綜述 CHO細(xì)胞中抗體的高表達(dá)的策略81-93
• References88-93
• 作者簡歷及在讀期間主要研究成果93

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 周宏;劉志剛;孫志偉;俞煒源;;CHO/dhfr~-細(xì)胞定點(diǎn)整合高效表達(dá)系統(tǒng)的建立[J];生物工程學(xué)報(bào);2007年04期

2 黃立強(qiáng),孫奮勇,林珊莉,吳翠玲;動物細(xì)胞雙順反子高效穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)建立[J];中國生物工程雜志;2004年10期

  本文關(guān)鍵詞：抗CD20抗體在CHO細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：438416