本文關(guān)鍵詞：基于化合物篩選技術(shù)對(duì)SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)能夠在機(jī)體內(nèi)起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵作用。大量的研究表明其異常調(diào)節(jié)與腫瘤有著直接和密切的聯(lián)系,所以研制和開發(fā)越來越多針對(duì)HDACs抑制作用的HDAC抑制劑(Histone deacetylases inhibition,HDACi),促使機(jī)體的乙酰化水平有所升高,從而達(dá)到治療更多類型實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤的前景。按照結(jié)構(gòu)類型的差異,HDAC抑制劑可分為:異羥肟酸類、苯甲酰胺類、環(huán)肽類、親電酮類等不同藥效基團(tuán)的小分子抑制劑,其中HDACi是通過哪些作用機(jī)制使腫瘤細(xì)胞死亡,目前為止關(guān)于這方面的研究較為透徹和深入,例如,增加細(xì)胞的凋亡性死亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化程度,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期的阻滯作用,觸發(fā)細(xì)胞自身發(fā)生自噬的作用,減少細(xì)胞的遷移能力和新血管的生成等等,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。隨著全球新增癌癥患者的增加和世界對(duì)于新藥開發(fā)節(jié)奏的加快,自2006年10月,在美國(guó)上市的SAHA作為世界上第一用于抑制HDAC的抗腫瘤藥物,研發(fā)不同類別HDACi和衍生物成為當(dāng)今新藥開發(fā)的主流方向,特別是抗癌藥物的市場(chǎng)隨著人民生活水平而急速擴(kuò)大。現(xiàn)有的HDACi由于靶標(biāo)性和亞型選擇性不強(qiáng)的原因,就會(huì)造成無選擇性地對(duì)一些生理性的HDAC產(chǎn)生作用,從而產(chǎn)生額外的副作用和毒性。由于近年來空氣污染等環(huán)境因素,肺癌的發(fā)生率急劇上升,診斷和治療具有很大的難度,同時(shí)也是全球關(guān)注的熱門和重點(diǎn)攻克的難題。研究目的:本課題首先通過對(duì)SAHA母體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)和原子相互作用力的分析基礎(chǔ)上,對(duì)表面識(shí)別區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾設(shè)計(jì),得到新的系列SAHA衍生物,并優(yōu)化合成技術(shù)路線和結(jié)構(gòu)鑒定,然后,進(jìn)行體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)、靶點(diǎn)HDACs作用實(shí)驗(yàn)和分子模擬對(duì)接論證,以篩選出作用效果理想和或毒性低的目標(biāo)衍生物,同時(shí),觀察其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬作用,以及初步探討凋亡和自噬信號(hào)通路的分子機(jī)制,為后期的研發(fā)工作提供一定的理論基礎(chǔ)。研究方法:通過對(duì)混合酸酐法反應(yīng)路徑和溶劑的優(yōu)化,合成多個(gè)SAHA衍生物,對(duì)粗產(chǎn)物采用聯(lián)合CH2Cl2、利用硅膠柱分離原理等多種方法進(jìn)行純化并用液相進(jìn)行純度的鑒定。在衍生物的結(jié)構(gòu)方面,(MS-ESI+)、13C-NMR、1H-NMR和IR四種常用的方法進(jìn)行鑒定。體外活性評(píng)價(jià)采用CCK-8方法,設(shè)置7個(gè)化合物濃度組,考察衍生物對(duì)多株肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的抗增殖活性以及毒性作用,篩選出效果較為理想的化合物作為候選。同時(shí)從計(jì)算機(jī)分子模擬方面進(jìn)行理論上的驗(yàn)證,使用軟件Auto Dock 6.0對(duì)衍生物和作用靶點(diǎn)HDAC8的結(jié)合力進(jìn)行測(cè)定,另外對(duì)結(jié)合力較強(qiáng)化合物的各個(gè)作用力參數(shù)深入的測(cè)定(包括:靜電相互作用、氫鍵相互作用、疏水相互作用、范德華力相互作用)。另外使用Elisa法,設(shè)置5個(gè)化合物濃度組,對(duì)總HDAC抑制活性進(jìn)行測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫法(Elisa)對(duì)相關(guān)的凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2)和自噬通路蛋白(Beclin-1)進(jìn)行正反向地檢測(cè)和研究。采用透射電鏡觀察衍生物是否能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬體的自噬現(xiàn)象。采用裸鼠皮下異種移植方法,評(píng)價(jià)其裸鼠體內(nèi)的抗肺癌效果,以及觀察其對(duì)心、肝、脾、肺和腎重要臟器的影響。通過Bliss法測(cè)定衍生物昆明小鼠腹腔注射給藥的LD50值,考察其急性毒性作用。研究結(jié)果:優(yōu)化混合酸酐法反應(yīng)路徑和條件后,成功地合成A系列化合物(N34、N4I、N4B、N24),其產(chǎn)率得到了較大的提高(56.3%~72.5%),完成了相關(guān)的結(jié)構(gòu)鑒定(MS-ESI+、13C-NMR、1H-NMR和IR)和純度鑒定(95%)。在系列A化合物體外抗肺癌細(xì)胞的研究中,均能表現(xiàn)出對(duì)肺癌細(xì)胞株較好的抗增殖效果,對(duì)正常細(xì)胞的毒性小,與陽性藥物SAHA對(duì)比,N34和N4I對(duì)SPC-A-1細(xì)胞株的藥效強(qiáng)且敏感,其中N34的IC50=0.9678μM為SAHA的1/4之多,呈現(xiàn)良好的構(gòu)效關(guān)系。對(duì)總HDAC抑制活性的篩選中,在SPC-A-1細(xì)胞株中N34的IC50=0.04379μM,達(dá)到納摩爾級(jí)別。通過計(jì)算機(jī)分子模擬與受體HDAC8的作用力測(cè)試中,N34與晶體內(nèi)部的氨基酸殘基結(jié)合表現(xiàn)最為突出,其自由能、靜電能和氫鍵作用力等均比SAHA強(qiáng)。對(duì)相關(guān)凋亡和自噬的蛋白研究中,N34能明顯提升Beclin-1、Caspase-3,Caspase-9蛋白表達(dá)的水平,在下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平的同時(shí),抑制Caspase凋亡途徑的信號(hào)通路后,可以較為明顯地觀察到Beclin-1蛋白水平的上調(diào)。B系列衍生物(N3F、N2E)的體外實(shí)驗(yàn)中,N3F同樣能夠較好地抑制肺癌細(xì)胞株(SPC-A-1)的增殖,且影響正常細(xì)胞的增殖方面較少。B系列化合物N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分別是183.7501mg/kg(95%置信區(qū)間為118.3983 mg/kg≤LD50≤285.1738 mg/kg)和312.7871mg/kg(95%置信區(qū)間為165.0207≤LD50≤592.8696)。在藥效評(píng)價(jià)和篩選中,選用皮下移植異種的荷瘤裸鼠,采用灌胃給藥方式,15天后對(duì)腫瘤體積和重量、裸鼠體重和臟器分配系數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示高、中劑量的N3F能夠明顯地抑制肺癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng),且能將抑瘤率提升到50%以上;給藥期間,各組荷瘤裸鼠均存活,體重均有不同程度的下降,隨劑量的減少,體重減少越多,高劑量組對(duì)體重影響比SAHA的小,在臟器分配系數(shù)中,僅肝臟的分配系數(shù)增大,說明其存在一定的毒副作用。通過透射電子顯微鏡的觀察,能看到N3F誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬的現(xiàn)象。研究結(jié)論:針對(duì)SAHA為母體,對(duì)其表面識(shí)別區(qū)進(jìn)行修飾,成功地得到系列衍生物(N34、N4I、N43、N24),并通過對(duì)混合酸酐法中所需的試劑和反應(yīng)條件的優(yōu)化進(jìn)行合成,其產(chǎn)率得到明顯改善,說明該優(yōu)化后的合成路徑較為理想。A系列化合物對(duì)多株肺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的抗增殖作用,其中N34對(duì)SPC-A-1細(xì)胞株的作用尤為突出,其作用強(qiáng)度和對(duì)靶點(diǎn)HDACS作用分別是SAHA的4倍多和10倍多,對(duì)正常細(xì)胞的毒性小,呈現(xiàn)良好的構(gòu)效關(guān)系;分子對(duì)接也證實(shí)了其晶體內(nèi)部氨基酸殘基的結(jié)合能力表現(xiàn)最為突出,自由能、靜電能和氫鍵作用力等均比SAHA強(qiáng);有顯著的上調(diào)自噬蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的作用。N3F對(duì)多株肺癌細(xì)胞增殖和裸鼠皮下肺癌荷瘤生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用,且能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬作用,效果均比原藥SAHA好,對(duì)肝臟有一定的不良作用,裸鼠體重也有所下降,但較原藥SAHA的輕。N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分別是183.7501mg/kg和312.7871mg/kg。本課題研究表明,以原藥為結(jié)構(gòu)母體進(jìn)行修飾設(shè)計(jì)的系列衍生物,其藥理作用基本能夠達(dá)預(yù)期的效果。
【關(guān)鍵詞】：新型SAHA衍生物 HDAC 肺癌 細(xì)胞自噬 機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R914;R96
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-15
• 前言15-24
• 第一部分 A系列衍生物的合成、活性評(píng)價(jià)和凋亡機(jī)制探討24-51
• 研究思路24-25
• 第一章 SAHA衍生物的化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)鑒定25-34
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑25-26
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 1.2.1 目標(biāo)化合物的化學(xué)合成27-28
• 1.2.2 目標(biāo)化合物各步產(chǎn)物的純化28-29
• 1.2.3 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)和純度鑒定29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 1.3.1 目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)30-31
• 1.3.2 目標(biāo)化合物的基團(tuán)顏色反應(yīng)31
• 1.3.3 目標(biāo)化合物的純度與產(chǎn)率31
• 1.3.4 目標(biāo)化合物的波譜數(shù)據(jù)31-33
• 1.4 討論33-34
• 第二章 SAHA衍生物的體外活性篩選和構(gòu)效關(guān)系論證34-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料34-36
• 2.1.1 細(xì)胞株34
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物配置34-35
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材35-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 2.2.1 抗肺癌細(xì)胞增殖的活性和正常細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)篩選36-37
• 2.2.2 作用HDAC抑制活性評(píng)價(jià)篩選（ELISA Kit）37-38
• 2.2.3 目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系論證38-39
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-41
• 2.3.1 抗肺癌增殖和HDAC抑制活性的IC5039-40
• 2.3.2 構(gòu)效關(guān)系分析40-41
• 2.4 討論41-43
• 第三章 基于AutoDock和受體HDAC-8 結(jié)合力的結(jié)構(gòu)參數(shù)驗(yàn)證43-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-45
• 3.3 討論45-46
• 第四章 SAHA衍生物對(duì)凋亡和自噬相關(guān)蛋白的通路研究46-51
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物配置46
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材46-47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 4.2.1 N34對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，9、Bcl-2 的影響47-48
• 4.2.2 N34對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 的影響48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-49
• 4.3.1 Caspase-3、9 和Bcl-2、Beclin-1 蛋白水平的變化48-49
• 4.4 討論49-51
• 第二部分 B系列衍生物的活性評(píng)價(jià)和誘導(dǎo)自噬作用51-70
• 研究思路51-52
• 第一章 N3F、N2E的體外藥效和體內(nèi)急性毒性評(píng)價(jià)52-58
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 1.1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物52
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物配置52-53
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材53
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 1.2.1 抗肺癌細(xì)胞增殖的活性和正常細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)篩選53
• 1.2.2 體內(nèi)急性毒性篩選53-54
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-57
• 1.3.1 抗肺癌細(xì)胞增殖作用54-56
• 1.3.2 小鼠體內(nèi)急性毒性LD5056-57
• 1.4 討論57-58
• 第二章 N3F體內(nèi)抗肺癌的作用研究58-66
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 2.1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物58
• 2.1.2 給藥劑量和藥物配置58-59
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和耗材59
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和收集59-60
• 2.2.2 構(gòu)建裸鼠皮下肺癌荷瘤模型60
• 2.2.3 分組和給藥觀察60
• 2.2.4 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定60-61
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-65
• 2.3.1 腫瘤體積變化的影響61-63
• 2.3.2 體重變化的影響63-64
• 2.3.3 臟器分配系數(shù)的影響64-65
• 2.4 討論65-66
• 第三章 N3F誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)66-70
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料66-67
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物配置66
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材66-67
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法67-68
• 3.2.1 透射電鏡觀察N3F誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的超微結(jié)構(gòu)變化67-68
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68
• 3.3.1 透射電鏡觀察N3F誘導(dǎo)自噬的體外結(jié)果68
• 3.4 討論68-70
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 數(shù)據(jù)處理和分析78
• 財(cái)政支持78-79
• 展望79-80
• 附圖（13C-NMR、1H-NMR、IR、HPLC、裸鼠藥效）80-96
• 附件96-99
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文和專利99-100
• 附錄 縮略詞表100-101
• 致謝101

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃偉斌;基于化合物篩選技術(shù)對(duì)SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機(jī)制研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：基于化合物篩選技術(shù)對(duì)SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：438572