本文關鍵詞：基于化合物篩選技術對SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases,HDACs)能夠在機體內起到調控基因轉錄的關鍵作用。大量的研究表明其異常調節(jié)與腫瘤有著直接和密切的聯(lián)系,所以研制和開發(fā)越來越多針對HDACs抑制作用的HDAC抑制劑(Histone deacetylases inhibition,HDACi),促使機體的乙酰化水平有所升高,從而達到治療更多類型實體瘤和非實體瘤的前景。按照結構類型的差異,HDAC抑制劑可分為:異羥肟酸類、苯甲酰胺類、環(huán)肽類、親電酮類等不同藥效基團的小分子抑制劑,其中HDACi是通過哪些作用機制使腫瘤細胞死亡,目前為止關于這方面的研究較為透徹和深入,例如,增加細胞的凋亡性死亡,促進腫瘤細胞的分化程度,誘導細胞發(fā)生周期的阻滯作用,觸發(fā)細胞自身發(fā)生自噬的作用,減少細胞的遷移能力和新血管的生成等等,從而促進腫瘤細胞的死亡。隨著全球新增癌癥患者的增加和世界對于新藥開發(fā)節(jié)奏的加快,自2006年10月,在美國上市的SAHA作為世界上第一用于抑制HDAC的抗腫瘤藥物,研發(fā)不同類別HDACi和衍生物成為當今新藥開發(fā)的主流方向,特別是抗癌藥物的市場隨著人民生活水平而急速擴大。現(xiàn)有的HDACi由于靶標性和亞型選擇性不強的原因,就會造成無選擇性地對一些生理性的HDAC產生作用,從而產生額外的副作用和毒性。由于近年來空氣污染等環(huán)境因素,肺癌的發(fā)生率急劇上升,診斷和治療具有很大的難度,同時也是全球關注的熱門和重點攻克的難題。研究目的:本課題首先通過對SAHA母體結構的特點和原子相互作用力的分析基礎上,對表面識別區(qū)結構進行修飾設計,得到新的系列SAHA衍生物,并優(yōu)化合成技術路線和結構鑒定,然后,進行體內外藥理實驗、靶點HDACs作用實驗和分子模擬對接論證,以篩選出作用效果理想和或毒性低的目標衍生物,同時,觀察其誘導腫瘤細胞自噬作用,以及初步探討凋亡和自噬信號通路的分子機制,為后期的研發(fā)工作提供一定的理論基礎。研究方法:通過對混合酸酐法反應路徑和溶劑的優(yōu)化,合成多個SAHA衍生物,對粗產物采用聯(lián)合CH2Cl2、利用硅膠柱分離原理等多種方法進行純化并用液相進行純度的鑒定。在衍生物的結構方面,(MS-ESI+)、13C-NMR、1H-NMR和IR四種常用的方法進行鑒定。體外活性評價采用CCK-8方法,設置7個化合物濃度組,考察衍生物對多株肺癌細胞和正常細胞的抗增殖活性以及毒性作用,篩選出效果較為理想的化合物作為候選。同時從計算機分子模擬方面進行理論上的驗證,使用軟件Auto Dock 6.0對衍生物和作用靶點HDAC8的結合力進行測定,另外對結合力較強化合物的各個作用力參數深入的測定(包括:靜電相互作用、氫鍵相互作用、疏水相互作用、范德華力相互作用)。另外使用Elisa法,設置5個化合物濃度組,對總HDAC抑制活性進行測定。采用酶聯(lián)免疫法(Elisa)對相關的凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2)和自噬通路蛋白(Beclin-1)進行正反向地檢測和研究。采用透射電鏡觀察衍生物是否能夠誘導肺癌細胞產生自噬體的自噬現(xiàn)象。采用裸鼠皮下異種移植方法,評價其裸鼠體內的抗肺癌效果,以及觀察其對心、肝、脾、肺和腎重要臟器的影響。通過Bliss法測定衍生物昆明小鼠腹腔注射給藥的LD50值,考察其急性毒性作用。研究結果:優(yōu)化混合酸酐法反應路徑和條件后,成功地合成A系列化合物(N34、N4I、N4B、N24),其產率得到了較大的提高(56.3%~72.5%),完成了相關的結構鑒定(MS-ESI+、13C-NMR、1H-NMR和IR)和純度鑒定(95%)。在系列A化合物體外抗肺癌細胞的研究中,均能表現(xiàn)出對肺癌細胞株較好的抗增殖效果,對正常細胞的毒性小,與陽性藥物SAHA對比,N34和N4I對SPC-A-1細胞株的藥效強且敏感,其中N34的IC50=0.9678μM為SAHA的1/4之多,呈現(xiàn)良好的構效關系。對總HDAC抑制活性的篩選中,在SPC-A-1細胞株中N34的IC50=0.04379μM,達到納摩爾級別。通過計算機分子模擬與受體HDAC8的作用力測試中,N34與晶體內部的氨基酸殘基結合表現(xiàn)最為突出,其自由能、靜電能和氫鍵作用力等均比SAHA強。對相關凋亡和自噬的蛋白研究中,N34能明顯提升Beclin-1、Caspase-3,Caspase-9蛋白表達的水平,在下調Bcl-2表達水平的同時,抑制Caspase凋亡途徑的信號通路后,可以較為明顯地觀察到Beclin-1蛋白水平的上調。B系列衍生物(N3F、N2E)的體外實驗中,N3F同樣能夠較好地抑制肺癌細胞株(SPC-A-1)的增殖,且影響正常細胞的增殖方面較少。B系列化合物N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分別是183.7501mg/kg(95%置信區(qū)間為118.3983 mg/kg≤LD50≤285.1738 mg/kg)和312.7871mg/kg(95%置信區(qū)間為165.0207≤LD50≤592.8696)。在藥效評價和篩選中,選用皮下移植異種的荷瘤裸鼠,采用灌胃給藥方式,15天后對腫瘤體積和重量、裸鼠體重和臟器分配系數進行監(jiān)測,結果顯示高、中劑量的N3F能夠明顯地抑制肺癌實體瘤的生長,且能將抑瘤率提升到50%以上;給藥期間,各組荷瘤裸鼠均存活,體重均有不同程度的下降,隨劑量的減少,體重減少越多,高劑量組對體重影響比SAHA的小,在臟器分配系數中,僅肝臟的分配系數增大,說明其存在一定的毒副作用。通過透射電子顯微鏡的觀察,能看到N3F誘導肺癌細胞發(fā)生自噬的現(xiàn)象。研究結論:針對SAHA為母體,對其表面識別區(qū)進行修飾,成功地得到系列衍生物(N34、N4I、N43、N24),并通過對混合酸酐法中所需的試劑和反應條件的優(yōu)化進行合成,其產率得到明顯改善,說明該優(yōu)化后的合成路徑較為理想。A系列化合物對多株肺癌細胞均表現(xiàn)出良好的抗增殖作用,其中N34對SPC-A-1細胞株的作用尤為突出,其作用強度和對靶點HDACS作用分別是SAHA的4倍多和10倍多,對正常細胞的毒性小,呈現(xiàn)良好的構效關系;分子對接也證實了其晶體內部氨基酸殘基的結合能力表現(xiàn)最為突出,自由能、靜電能和氫鍵作用力等均比SAHA強;有顯著的上調自噬蛋白和凋亡蛋白表達的作用。N3F對多株肺癌細胞增殖和裸鼠皮下肺癌荷瘤生長均有顯著的抑制作用,且能夠誘導肺癌細胞自噬作用,效果均比原藥SAHA好,對肝臟有一定的不良作用,裸鼠體重也有所下降,但較原藥SAHA的輕。N3F和N2E的小鼠腹腔注射LD50分別是183.7501mg/kg和312.7871mg/kg。本課題研究表明,以原藥為結構母體進行修飾設計的系列衍生物,其藥理作用基本能夠達預期的效果。
【關鍵詞】：新型SAHA衍生物 HDAC 肺癌 細胞自噬 機制
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R914;R96
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-15
• 前言15-24
• 第一部分 A系列衍生物的合成、活性評價和凋亡機制探討24-51
• 研究思路24-25
• 第一章 SAHA衍生物的化學合成與結構鑒定25-34
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.1.1 實驗試劑25-26
• 1.1.2 實驗儀器26-27
• 1.2 實驗方法27-30
• 1.2.1 目標化合物的化學合成27-28
• 1.2.2 目標化合物各步產物的純化28-29
• 1.2.3 目標化合物的結構和純度鑒定29-30
• 1.3 實驗結果30-33
• 1.3.1 目標化合物的化學結構30-31
• 1.3.2 目標化合物的基團顏色反應31
• 1.3.3 目標化合物的純度與產率31
• 1.3.4 目標化合物的波譜數據31-33
• 1.4 討論33-34
• 第二章 SAHA衍生物的體外活性篩選和構效關系論證34-43
• 2.1 實驗材料34-36
• 2.1.1 細胞株34
• 2.1.2 實驗試劑和藥物配置34-35
• 2.1.3 實驗儀器和耗材35-36
• 2.2 實驗方法36-39
• 2.2.1 抗肺癌細胞增殖的活性和正常細胞的毒性評價篩選36-37
• 2.2.2 作用HDAC抑制活性評價篩選（ELISA Kit）37-38
• 2.2.3 目標化合物的構效關系論證38-39
• 2.3 實驗結果39-41
• 2.3.1 抗肺癌增殖和HDAC抑制活性的IC5039-40
• 2.3.2 構效關系分析40-41
• 2.4 討論41-43
• 第三章 基于AutoDock和受體HDAC-8 結合力的結構參數驗證43-46
• 3.1 實驗方法43-44
• 3.2 實驗結果44-45
• 3.3 討論45-46
• 第四章 SAHA衍生物對凋亡和自噬相關蛋白的通路研究46-51
• 4.1 實驗材料46-47
• 4.1.1 實驗試劑和藥物配置46
• 4.1.2 實驗儀器和耗材46-47
• 4.2 實驗方法47-48
• 4.2.1 N34對凋亡相關蛋白Caspase-3，9、Bcl-2 的影響47-48
• 4.2.2 N34對自噬相關蛋白Beclin-1 的影響48
• 4.3 實驗結果48-49
• 4.3.1 Caspase-3、9 和Bcl-2、Beclin-1 蛋白水平的變化48-49
• 4.4 討論49-51
• 第二部分 B系列衍生物的活性評價和誘導自噬作用51-70
• 研究思路51-52
• 第一章 N3F、N2E的體外藥效和體內急性毒性評價52-58
• 1.1 實驗材料52-53
• 1.1.1 細胞株和實驗動物52
• 1.1.2 實驗試劑和藥物配置52-53
• 1.1.3 實驗儀器和耗材53
• 1.2 實驗方法53-54
• 1.2.1 抗肺癌細胞增殖的活性和正常細胞的毒性評價篩選53
• 1.2.2 體內急性毒性篩選53-54
• 1.3 實驗結果54-57
• 1.3.1 抗肺癌細胞增殖作用54-56
• 1.3.2 小鼠體內急性毒性LD5056-57
• 1.4 討論57-58
• 第二章 N3F體內抗肺癌的作用研究58-66
• 2.1 實驗材料58-59
• 2.1.1 細胞株和實驗動物58
• 2.1.2 給藥劑量和藥物配置58-59
• 2.1.3 實驗試劑、儀器和耗材59
• 2.2 實驗方法59-61
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)和收集59-60
• 2.2.2 構建裸鼠皮下肺癌荷瘤模型60
• 2.2.3 分組和給藥觀察60
• 2.2.4 相關指標測定60-61
• 2.3 實驗結果61-65
• 2.3.1 腫瘤體積變化的影響61-63
• 2.3.2 體重變化的影響63-64
• 2.3.3 臟器分配系數的影響64-65
• 2.4 討論65-66
• 第三章 N3F誘導肺癌細胞自噬實驗66-70
• 3.1 實驗材料66-67
• 3.1.1 實驗試劑和藥物配置66
• 3.1.2 實驗儀器和耗材66-67
• 3.2 實驗方法67-68
• 3.2.1 透射電鏡觀察N3F誘導肺癌細胞自噬的超微結構變化67-68
• 3.3 實驗結果68
• 3.3.1 透射電鏡觀察N3F誘導自噬的體外結果68
• 3.4 討論68-70
• 參考文獻70-78
• 數據處理和分析78
• 財政支持78-79
• 展望79-80
• 附圖（13C-NMR、1H-NMR、IR、HPLC、裸鼠藥效）80-96
• 附件96-99
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文和專利99-100
• 附錄 縮略詞表100-101
• 致謝101

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1 黃偉斌;基于化合物篩選技術對SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機制研究[D];廣東藥科大學;2016年

  本文關鍵詞：基于化合物篩選技術對SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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