本文關(guān)鍵詞：新型免疫調(diào)節(jié)分子VSIG4對Ⅱ型膠原誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：以牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型(基因背景：C57BL/6)關(guān)節(jié)炎模型小鼠為研究對象,探討新型免疫調(diào)節(jié)分子VSIG4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程中的影響。進(jìn)一步構(gòu)建VSIG4-Fc重組慢病毒載體和穩(wěn)定表達(dá)VSIG4-Fc的RAW264.7細(xì)胞株,并初步探討VSIG4-Fc對巨噬細(xì)胞活化的影響。方法：首先將VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)小鼠,以牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)與完全弗氏佐劑完全乳化制成乳劑后尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫獲得CIA模型。與同系正常小鼠比較分析小鼠關(guān)節(jié)改變,并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎臨床評分。用HE染色法檢測小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變、免疫組織化學(xué)染色法檢測關(guān)節(jié)中TNF-α IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等細(xì)胞因子的變化,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞以及腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α的變化。接下來將VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型C57BL/6小鼠,以牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)與完全弗氏佐劑完全乳化制成乳劑后尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫獲得膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)模型,定期觀察關(guān)節(jié)改變,并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎臨床評分。HE染色觀察小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)染色法檢測關(guān)節(jié)中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等細(xì)胞因子的變化。進(jìn)一步將目的基因VSIG4-Fc和PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV慢病毒載體以ECORI和BamHI進(jìn)行酶切后連接,獲得表達(dá)VSIG4-Fc的慢病毒載體,與輔助病毒載體以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞,獲得病毒北清后將其感染于RAW264.7細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。采用western blot法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中VSIG4的表達(dá)。進(jìn)一步使用定量PCR法體外分析VSIG4-Fc融合蛋白對骨髓來源巨噬細(xì)胞(BM-derived macrophages, BMDM)及其TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果：1.VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型膠原蛋白免疫后第9天開始出現(xiàn)明顯的多關(guān)節(jié)腫脹。小鼠踝關(guān)節(jié)病理檢測結(jié)果顯示明顯的滑膜增生,炎癥細(xì)胞浸潤以及關(guān)節(jié)壞死。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來源于VSIG4-/- CIA小鼠與同系正常小鼠相比,雖然脾淋巴CD4+T細(xì)胞分泌的TNF-α沒有顯著性差異(P0.05),但是腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α具有顯著性差異(P0.05)。此外,VSIG4-/-CIA小鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá)明顯高于同系正常小鼠(P0.05)。2.VSIG4-/-(基因背景：C57BL/6)及野生型(基因背景：C57BL/6) CIA小鼠均在初次免疫后第8天開始后腳掌出現(xiàn)明顯的紅腫,并且在初次免疫后第33天開始,VSIG4-/-模型組臨床評分明顯高于野生型模型組小鼠(P0.05)。小鼠踝關(guān)節(jié)病理檢測結(jié)果顯示明顯的滑膜增生,炎癥細(xì)胞浸潤以及關(guān)節(jié)壞死,并且VSIG4-/-C1A小鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL-Iβ、IL-17、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)明顯高于野生型CIA小鼠(P0.05)。3.成功構(gòu)建表達(dá)VSIG4-Fc的慢病毒載體,并獲得穩(wěn)定表達(dá)VSIG4-Fc基因的細(xì)胞株,鑒定結(jié)果顯示其穩(wěn)定高表達(dá)VSIG4。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VSIG4-Fc融合蛋白可抑制炎癥巨噬細(xì)胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子。結(jié)論：牛11型膠原蛋白可誘導(dǎo)VSIG44-小鼠的關(guān)節(jié)炎,其中腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α在其發(fā)病過程中可能起關(guān)鍵作用。且VSIG4的基因敲除可加劇Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥。并且VSIG4-Fc融合蛋白可抑制巨噬細(xì)胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等炎癥因子。此外,穩(wěn)定表達(dá)VISG4-Fc的RAW264.7轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的成功構(gòu)建,為VSIG4的功能研究提供了必要的手段。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型 T細(xì)胞 共刺激信號 VSIG4 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)VS/G4~(-/-)小鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立14-23
• 1.1 材料與儀器14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-18
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理18
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-23
• 第二部分 VSIG4基因敲除對牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎癥的作用23-28
• 2.1 材料與儀器23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 第三部分 穩(wěn)定表達(dá)VSIG4-Fc的RAW264.7細(xì)胞系的建立及VSIG4-Fc對巨噬細(xì)胞活化的影響28-41
• 3.1 材料和儀器28-29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-37
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理37
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 第四部分 討論與結(jié)論41-46
• 4.1 討論41-45
• 4.2 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 致謝53-54
• 文獻(xiàn)綜述54-65
• 參考文獻(xiàn)62-65

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本文編號：434381