本文關(guān)鍵詞：沒食子酸衍生物ZXHA-TC對兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的體內(nèi)外作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 探討沒食子酸衍生物ZXHA-TC對OA中軟骨退變的作用。方法：利用SYBYL軟件設(shè)計(jì)IL-1p的抑制劑；以沒食子酸為母核合成ZXHA-TC并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。采用兩步酶消化法對乳兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),MTT試驗(yàn)檢測ZXHA-TC及GA的毒性,ZXHA-TC及GA分別對軟骨細(xì)胞干預(yù)1h后,加入IL-1β刺激24h,提取RNA檢測MMP-1、MMP-13及TIMP-1基因的表達(dá)水平,并用免疫組織化學(xué)染色觀察MMP-1及Timp-1蛋白表達(dá)情況。2、4、6天后通過HE染色法、番紅O染色法、FDA/PI熒光染色法、免疫組織化學(xué)染色法及qRT-PCR法等研究ZXHA-TC對軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。從44只新西蘭兔隨機(jī)抽取8只作為正常對照組(A組),其余36只行雙膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷術(shù),8周后4只經(jīng)大體檢查及病理取材確定成OA模型,隨后隨機(jī)分為：模型組(B組)與受試藥物組(C組),每組16只。按設(shè)定劑量關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥(正常對照組不做任何處理,模型組注射生理鹽水)0.5mL,每周一次。給藥4周、8周后,分別處死動(dòng)物,取股骨內(nèi)髁軟骨標(biāo)本,進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)Pelletier評分；固定,脫鈣后石蠟包埋并切片,HE、Masson及番紅O染色并行Mankin軟骨評分,通過qRT-PCR與免疫組織化學(xué)染色法檢測相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),并使用免疫蛋白印記探索ZXHA-TC抑制骨關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。結(jié)果：根據(jù)SYBYL軟件計(jì)算出IL-1β蛋白的“活性口袋”坐標(biāo)并得到先導(dǎo)化合物GA；對GA進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到ZXHA-TC,其與“活性口袋”形成穩(wěn)定的復(fù)合物,表明其對IL-1β的活性可能具有明顯的抑制作用。通過MTT試驗(yàn),ZXHA-TC在濃度為6.25×10-7μg/mL,6.25×10-6μg/mL及6.25×10-5μg/mL時(shí)促進(jìn)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖,而沒食子酸在0.125μg/mL時(shí)對細(xì)胞的毒性相對較低。經(jīng)IL-1β誘導(dǎo),ZXHA-TC在濃度為6.25×10-6μg/mL時(shí),能明顯抑制MMP-1及MMP-13的表達(dá),而增加Timp-1的表達(dá)。軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)2、4、6天后,FDA/PI熒光染色顯示ZXHA-TC能很好地維持軟骨細(xì)胞活性；番紅O染色及DMMB試驗(yàn)顯示,GAG的分泌量在ZXHA-TC組時(shí)最高；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原在ZXHA-TC干預(yù)下的分泌較空白對照組及GA組多,而Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量則相反；經(jīng)ZXHA-TC的干預(yù),DNA含量明顯高于空白對照組及GA組；而qRT-PCR結(jié)果顯示ZXHA-TC組的蛋白聚糖、Sox9及Ⅱ型膠原基因的表達(dá)高于空白對照組及GA組,而Ⅰ型膠原基因的則相反,X型膠原基因未檢測到有表達(dá)。對大體觀察股骨髁并進(jìn)行評分,A組得分最低,B組4周及8周平均得分分別為2.63+0.74和3.25±0.71,C組4周及8周平均得分分別為1.38±0.52和2.25+0.89。Mankin組織學(xué)評分,A組的得分最低(0.34+0.01),給藥4周后,C組(1.37±0.06)得分低于B組(3.54±0.12)；給藥8周后,C組(2.15±0.11)得分遠(yuǎn)低于B組(5.83±0.32),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá),B組MMPs的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A組于C組,而Timp-1的表達(dá)在C組最高；p38及NF-κB在B組的表達(dá)明顯高于C組。另外,ZXHA-TC可能可以阻斷骨關(guān)節(jié)炎MAPK/p38及TLR/NF-κB通路以抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。結(jié)論：經(jīng)藥物虛擬篩選得到IL-1p抑制劑ZXHA-TC,其對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表型有保護(hù)作用,對兔骨關(guān)節(jié)炎有明顯的減緩作用,因此ZXHA-TC有望作為骨關(guān)節(jié)炎的治療藥物,且具有成本低廉,合成工藝簡單的優(yōu)勢。
【關(guān)鍵詞】：沒食子酸 ZXHA-TC 軟骨細(xì)胞 SYBYL 骨關(guān)節(jié)炎
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 個(gè)人簡歷3-8
• 主要英文縮寫詞語8-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-19
• 參考文獻(xiàn)17-19
• 第一部分 基于受體的藥物分子設(shè)計(jì)與沒食子酸衍生物ZXHA-TC的合成及結(jié)構(gòu)鑒定19-25
• 1 材料與方法19-21
• 1.1 試驗(yàn)試劑19
• 1.2 主要儀器19-20
• 1.3 方法20-21
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-23
• 2.1 分子設(shè)計(jì)結(jié)果21-22
• 2.2 化合物合成及結(jié)構(gòu)鑒定22-23
• 3 討論23-24
• 4 結(jié)論24
• 參考文獻(xiàn)24-25
• 第二部分 ZXHA-TC對體外炎癥及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的作用25-51
• 1 材料與方法25-35
• 1.1 試驗(yàn)試劑25
• 1.2 主要儀器25-27
• 1.3 方法27-35
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-45
• 2.1 MTT法測定ZXHA-TC的細(xì)胞毒性35
• 2.2 ZXHA-TC對IL-1 β誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的作用35-37
• 2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察37-38
• 2.4 細(xì)胞活性檢測38-39
• 2.5 qRT-PCR檢測基因相對表達(dá)量39-41
• 2.6 DNA含量測定41-42
• 2.7 GAG分泌及含量檢測42-44
• 2.8 Ⅰ型及Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色44-45
• 3 討論45-48
• 4 結(jié)論48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 第三部分 ZXHA-TC對兔骨關(guān)節(jié)炎的作用51-68
• 1 材料與方法51-57
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物51
• 1.2 主要試劑51-52
• 1.3 方法52-57
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-64
• 2.1 骨關(guān)節(jié)炎模型建立57-58
• 2.2 大體標(biāo)本觀察58-59
• 2.3 組織學(xué)檢查59-61
• 2.4 組織學(xué)評分61-62
• 2.5 關(guān)節(jié)炎特異基因表達(dá)62-63
• 2.6 相關(guān)信號通路研究63-64
• 3 討論64-66
• 4 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-68
• 綜述 骨關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究進(jìn)展68-88
• 1 動(dòng)物模型68-70
• 1.1 非手術(shù)法68-69
• 1.2 手術(shù)法69-70
• 2 發(fā)病機(jī)制70-77
• 2.1 信號通路70-72
• 2.2 細(xì)胞因子72-77
• 3 一般藥物治療77-79
• 3.1 癥狀控制藥77-78
• 3.2 關(guān)節(jié)軟骨成分補(bǔ)充劑78-79
• 3.3 OA致炎因子拮抗藥79
• 4 總結(jié)與展望79-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 致謝88-89
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文89

【參考文獻(xiàn)】

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：434349