發(fā)布時(shí)間：2017-06-06 14:25

  本文關(guān)鍵詞：pBcl-2小分子抑制劑的篩選及其分子藥理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞內(nèi)源凋亡通路的主要調(diào)控因子,包括具有促凋亡和抗凋亡功能的兩類蛋白質(zhì)。其中抗凋亡蛋白成員主要包括Bcl-2, Bcl-XL和Mcl-1,它們已經(jīng)被確認(rèn)為抗腫瘤靶標(biāo),正在進(jìn)行小分子BH3功能模擬研究。BH3功能模擬分子通過(guò)占據(jù)抗凋亡蛋白的BH3結(jié)合溝槽,釋放促凋亡蛋白Bax/Bak,或者釋放BH3-only蛋白激活Bax/Bak,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,是一類已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段的高效、高特異性的抗癌藥。近期研究發(fā)現(xiàn),磷酸化的Bcl-2蛋白(pBcl-2)也是一個(gè)重要的抗腫瘤靶標(biāo)。許多類型的腫瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白被高度磷酸化修飾,并且Bcl-2磷酸化水平與多種BH3功能模擬分子的抗性相關(guān)。例如,在多種白血病細(xì)胞系中,pBcl-2 (Ser70)抵抗ABT-737和Obatoclax的殺傷作用。但是,目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以直接靶向pBcl-2的小分子抑制劑,尤其是至今沒(méi)有關(guān)于pBcl-2的BH3溝槽的結(jié)構(gòu)研究,這也限制了pBcl-2小分子抑制劑的分子設(shè)計(jì)。本研究基于廣泛的BH3功能模擬分子的分子藥理機(jī)制、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究結(jié)論,提出如下假設(shè)：Bcl-2的磷酸化修飾別構(gòu)調(diào)節(jié)了BH3溝槽的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其或者增強(qiáng)了對(duì)促凋亡蛋白的親和力,或者在結(jié)構(gòu)上阻斷了現(xiàn)有BH3功能模擬分子的結(jié)合而引起藥物抗性。因此,本研究設(shè)計(jì)了基于細(xì)胞表型的pBcl-2抑制劑的篩選,在本課題組研發(fā)的BH3功能模擬分子S1的衍生物中,篩選可能被pBcl-2的BH3溝槽兼容的小分子,并研究其分子藥理機(jī)制,明確Bcl-2磷酸化修飾對(duì)其抗凋亡功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。本文首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法獲得分別表達(dá)非磷酸化Bcl-2 (npBcl-2)模擬蛋白(HA-AAA-Bcl-2; T69A/S70A/S87A)和pBcl-2模擬蛋白(HA-EEE-Bcl-2; T69E/S70E/S87E)的HL-60早幼粒白血病細(xì)胞,對(duì)23個(gè)S1衍生物進(jìn)行篩選。結(jié)合Bax-/-Bak-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的交叉篩選,得到了特異性依賴Bcl-2通路、拮抗pBcl-2功能的化合物S1-16。接下來(lái),通過(guò)ITC和ELIAS技術(shù)分別檢測(cè)了S1-16,S1和ABT-737對(duì)EEE-Bcl-2蛋白的親和力,以及與Bid-BH3肽段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EEE-Bcl-2 BH3結(jié)合溝槽的能力。結(jié)果表明S1-16能夠競(jìng)爭(zhēng)Bid-BH3肽段結(jié)合EEE-Bcl-2的BH3溝槽,而ABT-737和S1則不能。此外,通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了S1-16對(duì)EEE-Bcl-2蛋白的親和力來(lái)自于BH3結(jié)合溝槽。本論文通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了S1-16, S1, ABT-737對(duì)HL-60 (EEE-Bcl-2),OCI-AML3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白相互作用的影響,并用免疫印跡法檢測(cè)了Bax/Bak的激活、細(xì)胞色素C釋放、PARP的剪切。這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S1-16是通過(guò)解離細(xì)胞中pBcl-2/Bax和pBcl-2/Bak二聚體,誘導(dǎo)Bax/Bak依賴的內(nèi)源凋亡來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞的�；衔颯1-16是唯一一個(gè)能夠在過(guò)量表達(dá)EEE-Bcl-2和內(nèi)源Bcl-2高度磷酸化的腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡的BH3功能模擬分子。本研究篩選得到了首個(gè)pBcl-2直接抑制劑——S1-16。利用Sl-16,首次證實(shí)Bcl-2在loop區(qū)的磷酸化導(dǎo)致BH3溝槽的變構(gòu)效應(yīng),提出了pBcl-2 BH3的溝槽與npBcl-2BH3溝槽在結(jié)構(gòu)上的差異,為pBcl-2小分子抑制劑的設(shè)計(jì)及優(yōu)化提供分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時(shí),S1-16作為更廣譜的BH3功能模擬分子,不僅為腫瘤的治療提供了新的策略,也為研究Bcl-2蛋白磷酸化的意義提供了直接的分子工具。
【關(guān)鍵詞】：磷酸化Bcl-2 Bcl-2家族蛋白 BH3功能模擬分子 抗腫瘤
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R966
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-27
• 1.1 引言10
• 1.2 細(xì)胞凋亡與Bcl-2家族蛋白10-15
• 1.2.1 細(xì)胞凋亡的機(jī)理10-12
• 1.2.2 Bcl-2家族蛋白12-14
• 1.2.3 靶向Bcl-2的腫瘤治療14-15
• 1.3 小分子Bcl-2家族蛋白抑制劑的研究進(jìn)展15-22
• 1.3.1 HA14-115-16
• 1.3.2 抗霉素A16-17
• 1.3.3 Gossypol及其衍生物17-19
• 1.3.4 Obatoclax19-20
• 1.3.5 ABT-737及ABT-26320-21
• 1.3.6 S1及其衍生物21-22
• 1.4 Bcl-2蛋白的磷酸化研究進(jìn)展22-24
• 1.5 本研究工作的指導(dǎo)思想與研究目標(biāo)24-27
• 2 基于細(xì)胞模型的pBcl-2小分子抑制劑的篩選27-39
• 2.1 引言27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分27-32
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備27-29
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法29-32
• 2.3 結(jié)果與討論32-38
• 2.3.1 pBcl-2及npBcl-2過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞模型的構(gòu)建32-33
• 2.3.2 pBcl-2小分子抑制劑S1-16的篩選33-38
• 2.4 本章小結(jié)38-39
• 3 小分子抑制劑S1-16與EEE-Bcl-2蛋白的體外結(jié)合能力分析39-48
• 3.1 引言39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分39-41
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備39-40
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法40-41
• 3.3 結(jié)果與討論41-47
• 3.3.1 WT-Bcl-2和EEE-Bcl-2重組蛋白的活性檢測(cè)41-43
• 3.3.2 S1-16對(duì)EEE-Bcl-2蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用43-45
• 3.3.3 S1-16與EEE-Bcl-2 BH3溝槽的特異性結(jié)合45-47
• 3.4 本章小結(jié)47-48
• 4 S1-16誘導(dǎo)凋亡的分子藥理機(jī)制分析48-55
• 4.1 引言48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分48-49
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備48-49
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)原理與方法49
• 4.3 結(jié)果與討論49-54
• 4.3.1 S1-16對(duì)EEE-Bcl-2二聚體的解離及其凋亡誘導(dǎo)作用49-50
• 4.3.2 S1-16對(duì)pBcl-2二聚體的解離及其凋亡誘導(dǎo)作用50-54
• 4.4 本章小結(jié)54-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況62-63
• 致謝63-64

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