目的:構(gòu)建表達(dá)重組環(huán)氧合酶1 （COX1）真核表達(dá)載體,驗(yàn)證其體外能夠催化底物合成前列腺素E1 （PGE1）,以尋找高效獲得PGE1的方法。方法:提取人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMECs）總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,PCR擴(kuò)增人COX1基因,經(jīng)雙酶切后與真核表達(dá)載體pCMV6連接,構(gòu)建重組pCMV6-COX1真核表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)生物信息學(xué)在線工具分析COX1蛋白的疏水性、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293F細(xì)胞中,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK-293F細(xì)胞）、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒2d組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒5d組,分別收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清,Western blotting法檢測(cè)COX1蛋白表達(dá)水平。比較真核表達(dá)的COX1蛋白與羊精囊提取法制備的粗酶混合物催化底物二高-γ-亞麻酸合成PGE1的酶活性。結(jié)果:經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建pCMV6-COX1重組載體,目的基因長(zhǎng)度約為1 800bp。生物信息學(xué)分析,COX1蛋白為水溶性蛋白,1～53位氨基酸為信號(hào)肽,34～53位氨基酸處于跨膜區(qū)域,有36個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、14個(gè)蘇...

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器
    1.2 PCR擴(kuò)增目的基因COX1
    1.3 重組真核表達(dá)載體pCMV6-COX1的構(gòu)建
    1.4 COX1重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
    1.5 COX1蛋白生物信息學(xué)分析
    1.6 COX1基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞
    1.7 羊精囊提取粗酶混合物
    1.8 COX1酶催化二高-γ-亞麻酸合成PGE1含量的測(cè)定
    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 PCR擴(kuò)增目的基因COX1
    2.2 COX1基因真核表達(dá)載體的鑒定
    2.3 COX1蛋白生物信息學(xué)分析
    2.4 Western blotting法檢測(cè)HEK-293F細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中COX1蛋白表達(dá)水平
    2.5 真核表達(dá)COX1蛋白和羊精囊提取粗酶催化底物合成PGE的含量
3 討論



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