本文關(guān)鍵詞：匹諾塞林生物合成相關(guān)基因的克隆、功能鑒定及工程菌的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黃酮類化合物是植物中種類最多、分布最廣的次級代謝產(chǎn)物家族,目前有超過9000種黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)。其具有較多藥理活性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等,此外,黃酮類化合物在化妝品、工業(yè)原料等方面也有重要的應(yīng)用價值,使得黃酮類化合物一直是研究熱點。根據(jù)結(jié)構(gòu)骨架,可以分為黃酮醇、黃酮類、黃烷酮類、異黃酮類、兒茶素類和花色苷類。匹諾塞林是一種廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物,具有很好的生物活性,如神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗氧化等。在2009年,匹諾塞林被CFDA批準(zhǔn)為Ⅰ類注射新藥,主要用于治療急性腦卒中,現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗階段。匹諾塞林的良好成藥性使其合成方法備受關(guān)注。匹諾塞林可以通過化學(xué)合成、植物提取和合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。合成生物學(xué)技術(shù)是一種環(huán)境友好的工程化生物技術(shù),代表未來匹諾塞林的合成發(fā)展方向。匹諾塞林的生物合成途徑中有三個關(guān)鍵酶：對香豆酸輔酶A連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶。由于查爾酮異構(gòu)酶具有空間選擇性,利用合成生物學(xué)技術(shù)制備的匹諾塞林為2S構(gòu)型,單立體異構(gòu)體對藥物的申報上市具有很重要意義。本論文還進(jìn)行了法呢基焦磷酸合酶的研究。其作為一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶,可以催化IPP和DMAPP生成法呢烯焦磷酸(FPP),而FPP既參與合成倍半萜類化合物,也參與合成三萜皂苷和甾體皂苷等化合物,即FPPS處于單萜和倍半萜生物合成途徑分支處,是異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。對法呢基焦磷酸合成酶的研究為虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum)中萜類天然藥物生物合成途徑的重構(gòu)提供了必要的基因元件,為推動萜類天然藥物合成生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。本研究圍繞(2S)-匹諾塞林的合成生物學(xué)制備,從虎眼萬年青中克隆得到了匹諾塞林生物合成途徑中的三個關(guān)鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI,進(jìn)行了功能鑒定,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建工程菌,獲得了具有立體異構(gòu)體的(2S)-匹諾塞林,并研究了其藥理活性。主要取得如下結(jié)果：1.關(guān)鍵酶基因家族的克隆與表達(dá)通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析,通過提取總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,設(shè)計引物克隆得到匹諾塞林生物合成途徑中三個關(guān)鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI的unigene,其中Osa4CL家族含有7條unigene、OsaCHS家族含有3條unigene條和OsaCHI家族含有1條unigene,利用In-Fusion原理構(gòu)建了原核表達(dá)載體,并進(jìn)行誘導(dǎo),實現(xiàn)了Osa4CL1、Osa4CL2、Osa4CL3、Osa4CL4、Osa4CL5、Osa4CL6、Osa4CL7、 OsaCHS1、OsaCHS2、OsaCHS3和OsaCHI表達(dá)。2.關(guān)鍵酶的功能鑒定在一條代謝通路通中,只有一個未知功能酶,若驗證該途徑是通暢的,則可以說明該關(guān)鍵酶具有活性。本文通過構(gòu)建工程菌的方法對已經(jīng)實現(xiàn)表達(dá)的關(guān)鍵酶進(jìn)行功能鑒定,發(fā)現(xiàn)Osa4CL1、OsaCHS2和OssaCHI具有功能。工程菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)波譜解析鑒定了結(jié)構(gòu),特別是進(jìn)行了圓二色譜的檢測,產(chǎn)物為匹諾塞林,且為單立體異構(gòu)體,是2S構(gòu)型。首次對微生物來源的(2S)-匹諾塞林進(jìn)行了藥理學(xué)活性檢測,實驗?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。3.工程菌的構(gòu)建及優(yōu)化圍繞已構(gòu)建工程菌產(chǎn)量問題,本文從以下幾點對工程菌進(jìn)行優(yōu)化：選取高活性關(guān)鍵酶、模塊化組裝和對關(guān)鍵酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,即選擇紫花苜蓿來源的MsCHI,設(shè)計了三種模塊化組裝模式和對Osa4CL、OsaCHS和MsCHI進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。三種模塊化組裝模式中只有第一種具有催化活性,在對密碼子進(jìn)行優(yōu)化后,產(chǎn)量提高了1.66倍。4.法呢基焦磷酸合酶的研究通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析,得到了1327 bp的法呢基焦磷酸合酶基因unigene,通過ORF分析發(fā)現(xiàn)有1044 bp開放閱讀框,命名為OsaFPPS,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其等電點是5.01,進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物類FPPS家族。通過構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳及western-blot檢測,在體外酶促反應(yīng)后由GC-MS法檢測,發(fā)現(xiàn)其可以催化IPP和DMPP。
【關(guān)鍵詞】：虎眼萬年青 (2S)-匹諾塞林 合成生物學(xué) 對香豆酸輔酶A連接酶 查爾酮合酶 查爾酮異構(gòu)酶 法呢基焦磷酸合酶
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一部分 匹諾塞林生物合成相關(guān)基因的克隆功能鑒定及工程菌的構(gòu)建14-95
• 第一章 前言14-23
• 1.1 匹諾塞林生物合成途徑14-16
• 1.2 匹諾塞林生物生物活性16-18
• 1.3 匹諾塞林的制備方法18-19
• 1.3.1 匹諾塞林的化學(xué)合成18
• 1.3.2 匹諾塞林的植物提取18-19
• 1.3.3 匹諾塞林的生物合成19
• 1.4 提高合成生物學(xué)法合成匹諾塞林的策略19-21
• 1.5 匹諾塞林生物合成的意義21-22
• 1.6 虎眼萬年青中匹諾塞林相關(guān)基因克隆鑒定意義22-23
• 第二章 材料與方法23-33
• 2.1 主要儀器設(shè)備及生產(chǎn)廠家23-24
• 2.2 實驗材料24-27
• 2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品及常用試劑24-25
• 2.2.2 常見溶液配方25-27
• 2.3 植物材料27
• 2.4 抗生素的配制27
• 2.5 試劑盒及酶等生化試劑27-28
• 2.6 菌株及質(zhì)粒28
• 2.7 常用實驗方法28-33
• 2.7.1 感受態(tài)制備方法(CaCl_2法)28
• 2.7.2 克隆載體連接28
• 2.7.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化28-29
• 2.7.4 重組子的篩選29
• 2.7.5 重組蛋白的誘導(dǎo)29-30
• 2.7.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30
• 2.7.7 蛋白染色30
• 2.7.8 蛋白純化、透析及冷干30-31
• 2.7.9 Western-Blot方法31-32
• 2.7.10 密碼子優(yōu)化32
• 2.7.11 匹諾塞林工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵32-33
• 第三章 對香豆酸輔酶A連接酶功能鑒定33-43
• 引言33
• 3.1 實驗方法33-35
• 3.1.1 虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序及序列分析33
• 3.1.2 虎眼萬年青全cDNA合成及Osa4CL的克隆33-34
• 3.1.3 表達(dá)載體構(gòu)建34
• 3.1.4 重組Osa4CL蛋白表達(dá)和檢測34
• 3.1.5 Osa4CL蛋白酶功能鑒定34-35
• 3.2 實驗結(jié)果35-42
• 3.2.1 生物信息學(xué)分析35-39
• 3.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)檢測39-40
• 3.2.3 Osa4CL家族的功能鑒定40-42
• 3.3 本章小結(jié)42-43
• 第四章 查爾酮合酶和查爾酮異構(gòu)酶的克隆、功能鑒定43-68
• 引言43-44
• 4.1 實驗方法44-50
• 4.1.1 OsaCHS和OsaCHI克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建44-45
• 4.1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western-Blot檢測45
• 4.1.3 OsaCHS蛋白家族酶功能鑒定45-49
• 4.1.3.1 酶促反應(yīng)法45-46
• 4.1.3.2 構(gòu)建匹諾塞林工程菌法46-49
• 4.1.4 OsaCHI蛋白酶功能鑒定49-50
• 4.2 實驗結(jié)果50-66
• 4.2.1 OsaCHS和OsaCHI生物信息學(xué)分析50-54
• 4.2.2 OsaCHS和OsaCHI誘導(dǎo)表達(dá)和Western-Blot檢測54-55
• 4.2.3 OsaCHS功能鑒定55-65
• 4.2.3.1 體外酶促反應(yīng)鑒定法55-57
• 4.2.3.2 構(gòu)建工程菌法57-65
• 4.2.4 OsaCHI功能鑒定65-66
• 4.3 本章小結(jié)66-68
• 第五章 匹諾塞林工程菌的構(gòu)建及優(yōu)化68-79
• 引言68-69
• 5.1 實驗方法69-74
• 5.1.1 發(fā)酵產(chǎn)物定量69
• 5.1.2 關(guān)鍵酶物種選擇和模塊化組裝69-72
• 5.1.2.1 關(guān)鍵酶物種選擇69
• 5.1.2.2 模塊化組裝69-72
• 5.1.3 密碼子優(yōu)化72-74
• 5.2 實驗結(jié)果74-77
• 5.2.1 匹諾塞林標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制74-75
• 5.2.2 關(guān)鍵酶模塊化組裝75-76
• 5.2.3 密碼子優(yōu)化76-77
• 5.3 本章小結(jié)77-79
• 第六章 全文總結(jié)79-82
• 6.1 主要內(nèi)容和意義79-81
• 6.1.1 關(guān)鍵酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI基因家族的克隆與表達(dá)79
• 6.1.2 關(guān)鍵酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI蛋白家族的功能鑒定79-80
• 6.1.3 (2S)-匹諾塞林工程菌優(yōu)化80-81
• 6.2 本論文創(chuàng)新點81
• 6.3 工作展望81-82
• 參考文獻(xiàn)82-88
• 附錄88-95
• 附圖88-94
• 附表94-95
• 第二部分 來源于虎眼萬年青的法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定95-111
• 第一章 前言95-96
• 第二章 實驗材料和方法96-97
• 2.1 實驗材料96
• 2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及底物96
• 2.1.2 生化試劑和酶96
• 2.1.3 植物材料96
• 2.2 本實驗涉及溶液配方和操作96-97
• 第三章 實驗方法97-100
• 3.1 虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、序列分析及生物信息學(xué)分析97
• 3.2 OsaFPPS的基因克隆97-98
• 3.3 OsaFPPS的大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建98-99
• 3.4 OsaFPPS的表達(dá)、Western-Blot法驗證及純化99
• 3.5 OsaFPPS功能的鑒定99-100
• 第四章 實驗結(jié)果100-107
• 4.1 OsaFPPS基因的生物信息學(xué)分析及克隆100-103
• 4.1.1 生物信息學(xué)分析100-102
• 4.1.2 OsaFPPS的克隆102-103
• 4.2 OsaFPPS表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)、Western-Blot法驗證及純化103-104
• 4.2.1 OsaFPPS表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)及驗證103
• 4.2.2 OsaFPPS純化103-104
• 4.3 OsaFPPS功能鑒定104-107
• 第五章 實驗討論107-108
• 第六章 全文總結(jié)108-109
• 參考文獻(xiàn)109-111
• 致謝111-113
• 個人簡介113-114

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張必弦;朱延明;來永才;胡小梅;李煒;李琬;畢影東;肖佳雷;張俐俐;;植物查爾酮合酶(CHS)及其基因的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年20期

2 時麗麗;強(qiáng)桂芬;高梅;張恒艾;陳柏年;于曉彥;玄昭紅;王巧云;杜冠華;;匹諾塞林對腦線粒體呼吸功能的促進(jìn)作用[J];藥學(xué)學(xué)報;2011年06期

3 段亞波;戚燕;姬政;方剛;程永浩;吳松;;松屬素及其衍生物的合成與抗菌活性[J];中國藥物化學(xué)雜志;2006年06期

4 黃曉龍;淺談在立體異構(gòu)體新藥研究中需注意的問題[J];中國新藥雜志;2001年01期

  本文關(guān)鍵詞：匹諾塞林生物合成相關(guān)基因的克隆、功能鑒定及工程菌的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：393749