本文關鍵詞：匹諾塞林生物合成相關基因的克隆、功能鑒定及工程菌的構建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黃酮類化合物是植物中種類最多、分布最廣的次級代謝產(chǎn)物家族,目前有超過9000種黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)。其具有較多藥理活性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護等,此外,黃酮類化合物在化妝品、工業(yè)原料等方面也有重要的應用價值,使得黃酮類化合物一直是研究熱點。根據(jù)結(jié)構骨架,可以分為黃酮醇、黃酮類、黃烷酮類、異黃酮類、兒茶素類和花色苷類。匹諾塞林是一種廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物,具有很好的生物活性,如神經(jīng)保護、抗菌、抗氧化等。在2009年,匹諾塞林被CFDA批準為Ⅰ類注射新藥,主要用于治療急性腦卒中,現(xiàn)已經(jīng)進入Ⅱ期臨床試驗階段。匹諾塞林的良好成藥性使其合成方法備受關注。匹諾塞林可以通過化學合成、植物提取和合成生物學技術進行制備。合成生物學技術是一種環(huán)境友好的工程化生物技術,代表未來匹諾塞林的合成發(fā)展方向。匹諾塞林的生物合成途徑中有三個關鍵酶：對香豆酸輔酶A連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構酶。由于查爾酮異構酶具有空間選擇性,利用合成生物學技術制備的匹諾塞林為2S構型,單立體異構體對藥物的申報上市具有很重要意義。本論文還進行了法呢基焦磷酸合酶的研究。其作為一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶,可以催化IPP和DMAPP生成法呢烯焦磷酸(FPP),而FPP既參與合成倍半萜類化合物,也參與合成三萜皂苷和甾體皂苷等化合物,即FPPS處于單萜和倍半萜生物合成途徑分支處,是異戊二烯生物合成途徑中的關鍵酶。對法呢基焦磷酸合成酶的研究為虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum)中萜類天然藥物生物合成途徑的重構提供了必要的基因元件,為推動萜類天然藥物合成生物學的研究奠定基礎。本研究圍繞(2S)-匹諾塞林的合成生物學制備,從虎眼萬年青中克隆得到了匹諾塞林生物合成途徑中的三個關鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI,進行了功能鑒定,在此基礎上構建工程菌,獲得了具有立體異構體的(2S)-匹諾塞林,并研究了其藥理活性。主要取得如下結(jié)果：1.關鍵酶基因家族的克隆與表達通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析,通過提取總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,設計引物克隆得到匹諾塞林生物合成途徑中三個關鍵酶基因家族Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI的unigene,其中Osa4CL家族含有7條unigene、OsaCHS家族含有3條unigene條和OsaCHI家族含有1條unigene,利用In-Fusion原理構建了原核表達載體,并進行誘導,實現(xiàn)了Osa4CL1、Osa4CL2、Osa4CL3、Osa4CL4、Osa4CL5、Osa4CL6、Osa4CL7、 OsaCHS1、OsaCHS2、OsaCHS3和OsaCHI表達。2.關鍵酶的功能鑒定在一條代謝通路通中,只有一個未知功能酶,若驗證該途徑是通暢的,則可以說明該關鍵酶具有活性。本文通過構建工程菌的方法對已經(jīng)實現(xiàn)表達的關鍵酶進行功能鑒定,發(fā)現(xiàn)Osa4CL1、OsaCHS2和OssaCHI具有功能。工程菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)波譜解析鑒定了結(jié)構,特別是進行了圓二色譜的檢測,產(chǎn)物為匹諾塞林,且為單立體異構體,是2S構型。首次對微生物來源的(2S)-匹諾塞林進行了藥理學活性檢測,實驗目前正在進行中。3.工程菌的構建及優(yōu)化圍繞已構建工程菌產(chǎn)量問題,本文從以下幾點對工程菌進行優(yōu)化：選取高活性關鍵酶、模塊化組裝和對關鍵酶基因進行密碼子優(yōu)化,即選擇紫花苜蓿來源的MsCHI,設計了三種模塊化組裝模式和對Osa4CL、OsaCHS和MsCHI進行了密碼子優(yōu)化。三種模塊化組裝模式中只有第一種具有催化活性,在對密碼子進行優(yōu)化后,產(chǎn)量提高了1.66倍。4.法呢基焦磷酸合酶的研究通過對虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)分析,得到了1327 bp的法呢基焦磷酸合酶基因unigene,通過ORF分析發(fā)現(xiàn)有1044 bp開放閱讀框,命名為OsaFPPS,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)其等電點是5.01,進化樹分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物類FPPS家族。通過構建表達載體進行表達后經(jīng)SDS-PAGE電泳及western-blot檢測,在體外酶促反應后由GC-MS法檢測,發(fā)現(xiàn)其可以催化IPP和DMPP。
【關鍵詞】：虎眼萬年青 (2S)-匹諾塞林 合成生物學 對香豆酸輔酶A連接酶 查爾酮合酶 查爾酮異構酶 法呢基焦磷酸合酶
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一部分 匹諾塞林生物合成相關基因的克隆功能鑒定及工程菌的構建14-95
• 第一章 前言14-23
• 1.1 匹諾塞林生物合成途徑14-16
• 1.2 匹諾塞林生物生物活性16-18
• 1.3 匹諾塞林的制備方法18-19
• 1.3.1 匹諾塞林的化學合成18
• 1.3.2 匹諾塞林的植物提取18-19
• 1.3.3 匹諾塞林的生物合成19
• 1.4 提高合成生物學法合成匹諾塞林的策略19-21
• 1.5 匹諾塞林生物合成的意義21-22
• 1.6 虎眼萬年青中匹諾塞林相關基因克隆鑒定意義22-23
• 第二章 材料與方法23-33
• 2.1 主要儀器設備及生產(chǎn)廠家23-24
• 2.2 實驗材料24-27
• 2.2.1 標準品及常用試劑24-25
• 2.2.2 常見溶液配方25-27
• 2.3 植物材料27
• 2.4 抗生素的配制27
• 2.5 試劑盒及酶等生化試劑27-28
• 2.6 菌株及質(zhì)粒28
• 2.7 常用實驗方法28-33
• 2.7.1 感受態(tài)制備方法(CaCl_2法)28
• 2.7.2 克隆載體連接28
• 2.7.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化28-29
• 2.7.4 重組子的篩選29
• 2.7.5 重組蛋白的誘導29-30
• 2.7.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30
• 2.7.7 蛋白染色30
• 2.7.8 蛋白純化、透析及冷干30-31
• 2.7.9 Western-Blot方法31-32
• 2.7.10 密碼子優(yōu)化32
• 2.7.11 匹諾塞林工程菌的構建及發(fā)酵32-33
• 第三章 對香豆酸輔酶A連接酶功能鑒定33-43
• 引言33
• 3.1 實驗方法33-35
• 3.1.1 虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序及序列分析33
• 3.1.2 虎眼萬年青全cDNA合成及Osa4CL的克隆33-34
• 3.1.3 表達載體構建34
• 3.1.4 重組Osa4CL蛋白表達和檢測34
• 3.1.5 Osa4CL蛋白酶功能鑒定34-35
• 3.2 實驗結(jié)果35-42
• 3.2.1 生物信息學分析35-39
• 3.2.2 重組蛋白的誘導表達檢測39-40
• 3.2.3 Osa4CL家族的功能鑒定40-42
• 3.3 本章小結(jié)42-43
• 第四章 查爾酮合酶和查爾酮異構酶的克隆、功能鑒定43-68
• 引言43-44
• 4.1 實驗方法44-50
• 4.1.1 OsaCHS和OsaCHI克隆及表達載體的構建44-45
• 4.1.2 重組蛋白的誘導表達、純化及Western-Blot檢測45
• 4.1.3 OsaCHS蛋白家族酶功能鑒定45-49
• 4.1.3.1 酶促反應法45-46
• 4.1.3.2 構建匹諾塞林工程菌法46-49
• 4.1.4 OsaCHI蛋白酶功能鑒定49-50
• 4.2 實驗結(jié)果50-66
• 4.2.1 OsaCHS和OsaCHI生物信息學分析50-54
• 4.2.2 OsaCHS和OsaCHI誘導表達和Western-Blot檢測54-55
• 4.2.3 OsaCHS功能鑒定55-65
• 4.2.3.1 體外酶促反應鑒定法55-57
• 4.2.3.2 構建工程菌法57-65
• 4.2.4 OsaCHI功能鑒定65-66
• 4.3 本章小結(jié)66-68
• 第五章 匹諾塞林工程菌的構建及優(yōu)化68-79
• 引言68-69
• 5.1 實驗方法69-74
• 5.1.1 發(fā)酵產(chǎn)物定量69
• 5.1.2 關鍵酶物種選擇和模塊化組裝69-72
• 5.1.2.1 關鍵酶物種選擇69
• 5.1.2.2 模塊化組裝69-72
• 5.1.3 密碼子優(yōu)化72-74
• 5.2 實驗結(jié)果74-77
• 5.2.1 匹諾塞林標準曲線繪制74-75
• 5.2.2 關鍵酶模塊化組裝75-76
• 5.2.3 密碼子優(yōu)化76-77
• 5.3 本章小結(jié)77-79
• 第六章 全文總結(jié)79-82
• 6.1 主要內(nèi)容和意義79-81
• 6.1.1 關鍵酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI基因家族的克隆與表達79
• 6.1.2 關鍵酶Osa4CL、OsaCHS和OsaCHI蛋白家族的功能鑒定79-80
• 6.1.3 (2S)-匹諾塞林工程菌優(yōu)化80-81
• 6.2 本論文創(chuàng)新點81
• 6.3 工作展望81-82
• 參考文獻82-88
• 附錄88-95
• 附圖88-94
• 附表94-95
• 第二部分 來源于虎眼萬年青的法呢基焦磷酸合酶基因的克隆、表達及功能鑒定95-111
• 第一章 前言95-96
• 第二章 實驗材料和方法96-97
• 2.1 實驗材料96
• 2.1.1 標準品及底物96
• 2.1.2 生化試劑和酶96
• 2.1.3 植物材料96
• 2.2 本實驗涉及溶液配方和操作96-97
• 第三章 實驗方法97-100
• 3.1 虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序、序列分析及生物信息學分析97
• 3.2 OsaFPPS的基因克隆97-98
• 3.3 OsaFPPS的大腸桿菌表達載體構建98-99
• 3.4 OsaFPPS的表達、Western-Blot法驗證及純化99
• 3.5 OsaFPPS功能的鑒定99-100
• 第四章 實驗結(jié)果100-107
• 4.1 OsaFPPS基因的生物信息學分析及克隆100-103
• 4.1.1 生物信息學分析100-102
• 4.1.2 OsaFPPS的克隆102-103
• 4.2 OsaFPPS表達載體構建、表達、Western-Blot法驗證及純化103-104
• 4.2.1 OsaFPPS表達載體構建、表達及驗證103
• 4.2.2 OsaFPPS純化103-104
• 4.3 OsaFPPS功能鑒定104-107
• 第五章 實驗討論107-108
• 第六章 全文總結(jié)108-109
• 參考文獻109-111
• 致謝111-113
• 個人簡介113-114

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張必弦;朱延明;來永才;胡小梅;李煒;李琬;畢影東;肖佳雷;張俐俐;;植物查爾酮合酶(CHS)及其基因的研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2012年20期

2 時麗麗;強桂芬;高梅;張恒艾;陳柏年;于曉彥;玄昭紅;王巧云;杜冠華;;匹諾塞林對腦線粒體呼吸功能的促進作用[J];藥學學報;2011年06期

3 段亞波;戚燕;姬政;方剛;程永浩;吳松;;松屬素及其衍生物的合成與抗菌活性[J];中國藥物化學雜志;2006年06期

4 黃曉龍;淺談在立體異構體新藥研究中需注意的問題[J];中國新藥雜志;2001年01期

  本文關鍵詞：匹諾塞林生物合成相關基因的克隆、功能鑒定及工程菌的構建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：393749