目的本研究旨在應(yīng)用體外培養(yǎng)的人源心肌細(xì)胞揭示曲格列酮誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性特征,并從線粒體氧化應(yīng)激和自噬角度探討其潛在的毒作用機(jī)制。方法應(yīng)用人源心肌細(xì)胞AC16,給予不同濃度的曲格列酮處理24 h,通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變;CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率;LDH檢測(cè)膜完整性評(píng)價(jià)藥物的細(xì)胞毒性。應(yīng)用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng),利用熒光探針TMRM和CM-H₂DCFDA檢測(cè)線粒體膜電位和全細(xì)胞活性氧自由基的水平;利用熒光素酶化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP含量變化;應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)mtDNA變化評(píng)價(jià)藥物線粒體毒性。Western blotting檢測(cè)調(diào)控線粒體新生的PGC-1α信號(hào)通路和調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化的Nrf2信號(hào)通路;自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值和p62蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比,曲格列酮可劑量依賴性引起細(xì)胞質(zhì)皺縮、細(xì)胞存活率顯著下降(r=-0.928,P<0.05)和LDH漏出增加(r=0.746,P<0.05);給予10、20μM的曲格列酮可明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位、mtDNA拷貝數(shù)、ATP含量,增加活性氧自由基含量(P<0.05);曲格列酮可顯著...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中英文縮略詞對(duì)照表
摘要
Abstract
前言
第一部分 曲格列酮對(duì)AC16細(xì)胞毒性作用的影響
    1.1 前言
    1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑
        1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)主要耗材
        1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)主要儀器
        1.2.5 溶液配制
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 AC16 細(xì)胞的培養(yǎng)
        1.3.2 形態(tài)觀察
        1.3.3 CCK-8 法測(cè)細(xì)胞存活率
        1.3.4 LDH法測(cè)細(xì)胞膜完整性
        1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.4.1 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞形態(tài)的影響
        1.4.2 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞存活率的影響
        1.4.3 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞LDH漏出的影響
    1.5 討論
    1.6 小結(jié)
第二部分 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞線粒體功能的影響
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要耗材
        2.2.4 主要儀器
        2.2.5 溶液配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 AC16 細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.2 Mito SOX Red測(cè)線粒體ROS
        2.3.3 CM-H2DCFDA測(cè)全細(xì)胞ROS
        2.3.4 Mito tracker Green測(cè)線粒體含量
        2.3.5 TMRM測(cè)線粒體膜電位
        2.3.6 RT-qPCR測(cè) mtDNA
        2.3.7 熒光素酶測(cè)ATP含量
        2.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞ROS的影響
        2.4.2 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞線粒體含量和膜電位的影響
        2.4.3 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞mtDNA的影響
        2.4.4 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞ATP含量的影響
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三部分 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞PGC-1α和 Nrf2 通路的影響
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要耗材
        3.2.4 主要儀器
        3.2.5 Western blotting主要試劑配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 AC16 細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.2 蛋白免疫印跡
        3.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞PGC-1α通路的影響
        3.4.2 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞Nrf2 通路的影響
        3.4.3 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞PGC-1α和 Nrf2 通路的時(shí)間效應(yīng)
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四部分 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞自噬的影響
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 主要耗材
        4.2.4 主要儀器
        4.2.5 溶液配制
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 AC16 細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.3.2 蛋白免疫印跡
        4.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 曲格列酮對(duì)AC16 細(xì)胞自噬蛋白的影響
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
討論
致謝
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
導(dǎo)師評(píng)閱表



本文編號(hào)：3885786