背景及目的:原肌球蛋白受體激酶(Trks)是一類神經(jīng)營養(yǎng)因子受體,包括TrkA,Trk B和TrkC三個亞型,神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophins)與Trk的結(jié)合能夠誘導受體的二聚化和磷酸化,并激活下游PI3K/Akt/mTOR、PLCγ和Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)通路,從而調(diào)控著腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、遷移、血管生成及耐藥性。本論文主要開展Trk小分子抑制劑GZD2202的體內(nèi)外抗神經(jīng)母細胞瘤的作用及機制研究。方法:本論文首先使用Z’-LYTE^TM激酶活性測試方法對GZD2202進行體外激酶活性測試,然后采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法對神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y進行pRP-TrkB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建并得到了TrkB高表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y-Trk B,再使用CCK-8考察GZD2202體外抗BDNF誘導的神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖活性。Wound healing劃痕實驗及Transwell侵襲遷移實驗考察GZD2202對BDNF誘導的神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲和遷移的影響,Western Blot法研究GZD2202體外抗增殖及抗轉(zhuǎn)移的機制。在此基礎(chǔ)上進...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文對照及縮寫
第一章 緒論
    1.1 神經(jīng)母細胞瘤
        1.1.1 神經(jīng)母細胞瘤概況
        1.1.2 神經(jīng)母細胞瘤的靶向治療靶標
    1.2 Trk
        1.2.1 Trk概況
        1.2.2 Trk下游信號通路
        1.2.3 Trk與腫瘤
    1.3 Trk可作為神經(jīng)母細胞瘤的治療靶標
    1.4 Trk抑制劑研究現(xiàn)狀
    1.5 立題依據(jù)
第二章 SH-SY5Y-TrkB穩(wěn)定株的構(gòu)建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要實驗耗材和儀器
        2.1.2 主要實驗試劑
        2.1.3 細胞系
        2.1.4 主要實驗試劑和溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 因子儲備液的配制與保存
        2.2.2 細胞培養(yǎng)
        2.2.3 大腸桿菌的培養(yǎng)
        2.2.4 大腸桿菌質(zhì)粒的提取
        2.2.5 嘌呤霉素最佳篩選濃度的確定
        2.2.6 pRP-TrkB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        2.2.7 穩(wěn)定株的鑒定
        2.2.8 WesternBlot法檢測BDNF對TrkB及其下游信號通路的作用
        2.2.9 CCK-8法檢測BDNF對SH-SY5Y及SH-SY5Y-TrkB細胞增殖的影響
        2.2.10 克隆形成實驗檢測BDNF對SH-SY5Y及SH-SY5Y-TrkB細胞克隆形成的影響
        2.2.11 Transwell實驗檢測BDNF對SH-SY5Y及SH-SY5Y-TrkB細胞遷移能力的影響
        2.2.12 WesternBlot法檢測BDNF對侵襲遷移相關(guān)蛋白表達的影響
    2.3 實驗結(jié)果與討論
        2.3.1 TrkB在SH-SY5Y-TrkB細胞中mRNA水平高表達
        2.3.2 TrkB在SH-SY5Y-TrkB細胞中蛋白水平高表達
        2.3.3 BDNF激活TrkB及其下游信號通路
        2.3.4 TrkB的激活促進神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖
        2.3.5 TrkB的激活促進神經(jīng)母細胞瘤細胞克隆形成
        2.3.6 TrkB的激活促進神經(jīng)母細胞瘤細胞侵襲和遷移
        2.3.7 BDNF上調(diào)MMP2/MMP9的表達
    2.4 本章小結(jié)
第三章 GZD2202體外活性研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要實驗儀器
        3.1.2 主要實驗試劑
        3.1.3 細胞系
        3.1.4 藥物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 化合物及因子儲備液的配制與保存
        3.2.2 細胞培養(yǎng)
        3.2.3 激酶活性測試(Z’-LYTETMkinaseassay)
        3.2.4 CCK-8法檢測受試化合物抗增殖活性
        3.2.5 Wound healing實驗檢測GZD2202對BDNF誘導的SH-SY5Y-TrkB細胞遷移能力的影響
        3.2.6 Transwell實驗檢測GZD2202對BDNF誘導的SH-SY5Y-TrkB細胞侵襲能力的影響
    3.3 實驗結(jié)果與討論
        3.3.1 GZD2202是一個新骨架Trk抑制劑
        3.3.2 GZD2202抑制BDNF誘導的SH-SY5Y-TrkB細胞增殖
        3.3.3 GZD2202抑制BDNF誘導的SH-SY5Y-TrkB細胞克隆形成
        3.3.4 GZD2202抑制BDNF誘導的SH-SY5Y-TrkB細胞的侵襲和遷移
    3.4 本章小結(jié)
第四章 GZD2202體外抗腫瘤作用機制研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要實驗儀器
        4.1.2 主要實驗試劑
        4.1.3 抗體
        4.1.4 細胞系
        4.1.5 藥物
    4.2 實驗方法
        4.2.1 WesternBlot實驗檢測GZD2202對TrkB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響
        4.2.2 WesternBlot實驗檢測GZD2202對SH-SY5Y-TrkB細胞中遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的影響
    4.3 實驗結(jié)果與討論
        4.3.1 GZD2202抑制BDNF誘導的TrkB及其下游信號通路的活化
        4.3.2 GZD2202抑制BDNF誘導的MMP2/MMP9的表達
    4.4 本章小結(jié)
第五章 GZD2202體內(nèi)抗SH-SY5Y-TrkB小鼠移植瘤活性及其機制研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 動物
        5.1.2 藥物
        5.1.3 細胞系
        5.1.4 主要儀器、實驗器材及實驗試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 D2202的準備
        5.2.2 SH-SY5Y-TrkB小鼠體內(nèi)移植瘤模型的建立
        5.2.3 動物分組及給藥
        5.2.4 TUNEL法觀察GZD2202對各荷瘤鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響
    5.3 實驗結(jié)果與討論
        5.3.1 GZD2202抑制SH-SY5Y-TrkB小鼠體內(nèi)移植瘤的生長
        5.3.2 GZD2202促進腫瘤組織細胞發(fā)生凋亡
    5.4 本章小結(jié)
第六章 全文總結(jié)
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新之處
    6.3 展望
參考文獻
在校期間撰寫及發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3798061