本文關鍵詞：新型靶向抗腫瘤藥物LPO的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豹蛙酶(Onconase,ONC)是一種新型抗腫瘤制劑,能夠在體內靶向的選擇殺傷腫瘤細胞,是目前世界上新研發(fā)的抗腫瘤藥物,現(xiàn)已開展惡性間皮瘤的臨床三期試驗及非小肺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗。由于ONC具有良好的安全性,能夠延長腫瘤患者的生存期。同時臨床試驗數(shù)據(jù)也顯示出了ONC的一些弊端:(1)ONC的藥代動力學試驗與體內分布學試驗結果不佳;(2)它的分子量較小,僅為104個氨基酸組成的小分子蛋白,由于選擇性不高,進入體內后不能迅速作用于癌細胞,在體內半衰期較短,且有嚴重的腎毒性,因此在臨床應用時不能大劑量、短周期的用藥,對腫瘤治療造成了一定的阻礙。在本課題中,針對ONC的諸多不足進行了基因修飾。(1)針對ONC選擇性差,本研究為其添加了可靶向作用于癌細胞的導向因子LHRH。加入導向后使重組ONC蛋白迅速尋找并特異性結合癌癥細胞,減少在血液中停留的時間,增強了ONC的靶向性與半衰期,降低腎毒性;(2)在LHRH后添加了轉膜肽,當LHRH識別癌癥細胞表面的受體LHRHR后并與其結合,在轉膜肽的幫助下,ONC分子快速進入細胞內吞小泡,在內吞小泡中低p H作用下Furin酶發(fā)揮作用切割分離ONC單體與LHRH,從而釋放ONC進入細胞發(fā)揮其核糖核酸酶活性。通過對該藥物的靶向性改造,以期獲得一種新型抗腫瘤藥物候選品種。研究內容1.人工合成帶有NcoⅠ、Eco RⅠ酶切位點的重組LPO全基因片段并克隆入PGEM-T載體中,以NcoⅠ、Eco RⅠ內切酶消化PGEM-T-LPO和p ET-20b表達載體,分別回收目的基因片段和載體片段,利用T4連接酶連接載體與目的片段形成新的重組表達質粒。轉化E.coli.JM109,通過培養(yǎng)、質粒提取、酶切鑒定、PCR鑒定,選取測序完全正確的重組質粒轉化感受態(tài)E.coli BL21(DE3),以1mmol/L IPTG為誘導劑誘導表達菌生產(chǎn)目的蛋白。SDS-PAGE檢測目的蛋白以包涵體形式表達,表達量約為25%左右,用Triton-x-100、尿素洗滌劑進行包涵體的洗滌,最終通過6mol/L鹽酸胍溶解包涵體并進行復性,復性后經(jīng)陽離子交換層析得到純度較高的目的蛋白,但重組蛋白復性難度較大,且復性收率較低。研究內容2.重新合成引物,以p ET-20b-LPO為模版,擴增出兩端帶有Bam HⅠ、XhoⅠ限制性內切酶位點的LPO目的片段,克隆入本室構建保存的p ET-Trx A-SUMO載體中,構建多種分子伴侶融合表達的Trx A-SUMO-LPO表達質粒,將重組質粒轉化感受態(tài)E.coli.JM109中,培養(yǎng)后小提質粒,由庫美公司進行序列測定,選擇測序正確的質粒轉化感受態(tài)E.coli BL21(DE3),以1mmol/L IPTG為誘導劑誘導表達菌生產(chǎn)Trx A-SUMO-LPO融合蛋白。SDS-PAGE檢測目的蛋白以包涵體仍以形式表達,表達量約為30%左右,用5%Triton-x-100、0.5mol/L鹽酸胍洗滌包涵體,最終通過6mol/L鹽酸胍溶解包涵體并進行復性,增加分子伴侶融合表達后,復性較易,且純化工藝簡便。研究內容3通過對Trx A-SUMO-LPO的純化及Sumo酶切割,獲得到純度95%的LPO目的蛋白,用Lowry試劑法測定目的蛋白濃度為0.85mg/m L,用含10%FBS的RPMI1640透析后過濾除菌,按倍比稀釋濃度加入到每孔含5000個細胞的96孔培養(yǎng)板中,檢測LPO對不同腫瘤細胞的抑制和殺滅作用,結果發(fā)現(xiàn)LPO對子宮內膜癌Ishikawa細胞有較強的抑制和殺傷作用。
【關鍵詞】：豹蛙酶 LPO 抗癌藥物 蛋白純化
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R979.1;Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文獻綜述10-23
• 第一章 豹蛙酶的研究進展10-20
• 1.1 豹蛙酶簡介10
• 1.2 豹蛙酶主要結構10-12
• 1.3 豹蛙酶的體外作用目標12
• 1.4 豹蛙酶的分子構象12-14
• 1.5 豹蛙酶的細胞生長抑制和細胞毒性特點14-15
• 1.6 豹蛙酶的內化15-16
• 1.7 豹蛙酶內陷后的作用目標16-18
• 1.8 豹蛙酶對細胞循環(huán)影響與誘導細胞凋亡18-20
• 第二章 促黃體激素釋放激素20-23
• 2.1 促黃體激素釋放激素20
• 2.2 LHRH的分布以及功能20-21
• 2.3 LHRH受體的分布以及與腫瘤治療的關系21-23
• 第二篇 研究內容23-57
• 第一章 pET-20b-LPO基因構建表達及純化23-34
• 1.1 試驗材料23-25
• 1.2 試驗方法25-29
• 1.2.1 重組pET-20b-LPO質粒的構建25-28
• 1.2.2 工程菌pET-20b-LPO/ BL21（DE3）的制備與誘導表達28
• 1.2.3 融合蛋白LPO的純化28-29
• 1.3 結果29-32
• 1.4 討論32-33
• 1.5 小結33-34
• 第二章 TrxA-SUMO-LPO的構建表達及純化34-50
• 2.1 試驗材料34-36
• 2.2 試驗方法36-42
• 2.2.1 重組TrxA-SUMO-LPO質粒的構建36-38
• 2.2.2 重組融合蛋白TrxA-SUMO-LPO的表達優(yōu)化38-39
• 2.2.3 工程菌株高密度發(fā)酵39-41
• 2.2.4 融合蛋白TrxA-SUMO-LPO的純化41-42
• 2.3 結果42-47
• 2.4 討論47-48
• 2.5 小結48-50
• 第三章 LPO對體外癌細胞抑制試驗50-57
• 3.1 試驗材料50-51
• 3.2 試驗方法51-52
• 3.2.1 細胞復蘇51
• 3.2.2 細胞鋪板51-52
• 3.2.3 LPO毒性試驗52
• 3.3 結果52-55
• 3.4 討論55-56
• 3.5 小結56-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-64
• 附錄A64-65
• 作者簡介65-66
• 致謝66

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李飛;范黎;李偉;吳紅;;LHRH-PEG-PHIS膠束的制備與性質研究(英文)[J];納米科技;2013年04期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王云;NF-κBp65 siRNA對口腔鱗癌Tac8113細胞株增殖、凋亡和耐藥的影響[D];瀘州醫(yī)學院;2013年

  本文關鍵詞：新型靶向抗腫瘤藥物LPO的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：378018