本文關(guān)鍵詞：耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ抗甲型流感病毒作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感病毒是研究最早的病毒之一,它具有發(fā)病快,傳播迅速的特點(diǎn),能在極短短時(shí)間內(nèi)造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球的流行。21世紀(jì)以來,流感病毒先后幾次大規(guī)模流行,如2005年的H5N1禽流感,2009年的甲型H1N1流感以及最近爆發(fā)的H7N9甲型流感等。但目前國際上普遍應(yīng)用的抗甲流的藥物主要為離子通道阻斷劑(M2 ion channel blockers)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAIs)兩種,且現(xiàn)在都已出現(xiàn)病毒耐藥性。因此探索針對(duì)新靶點(diǎn)的抗甲流藥物意義十分重大。細(xì)胞的受體酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase,RTKs)是存在于細(xì)胞表面的一系列生長因子的受體,它對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長,代謝和分化有著十分重要的意義。RTK及其下游信號(hào)通路與甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)的感染和復(fù)制有著密切的聯(lián)系。因此,通過靶向宿主細(xì)胞中的RTKs分子及其下游信號(hào)通路來尋找抗甲流藥物可以獲得新靶點(diǎn)藥物,且避開了已有的抗甲流藥物易產(chǎn)生病毒耐藥性的缺點(diǎn)。本論文的研究對(duì)象為來源于云南建水紫陶土的耐酸真菌Penicillium purpurogenum JS03-21產(chǎn)生的一種雙環(huán)酮類的小分子化合物PQ。前期研究發(fā)現(xiàn)其具有體外抑制甲型流感病毒的效果。本論文主要從體內(nèi)外水平上全面探究PQ抗IAV的作用機(jī)理,以期為新型抗IAV藥物的研發(fā)提供理論參考。本論文通過利用MDCK細(xì)胞系和PR8毒株建立的體外抗病毒模型對(duì)耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ的抗病毒效果進(jìn)行初步的測(cè)定。通過檢測(cè)加入PQ之后的細(xì)胞病變抑制率和細(xì)胞上清液神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)活力,評(píng)價(jià)PQ的抗甲型流感病毒的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入PQ之后,MDCK細(xì)胞的病變率明顯降低,NA滴度明顯降低,其半數(shù)抑制濃度IC5o為26.4μg/mL。說明PQ在細(xì)胞水平具有良好的抗病毒效果。本論文進(jìn)一步探究小分子化合物PQ的抗病毒作用機(jī)制。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PQ不同的作用時(shí)間下,病毒核蛋白(nucleprotein,NP)在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。研究結(jié)果表明,PQ的加入可能延緩了NP蛋白的入核和出核過程,從而大大降低了病毒的增殖數(shù)量。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PQ能抑制與流感病毒復(fù)制相關(guān)的RTK通路中相關(guān)蛋白的激活,進(jìn)而抑制流感病毒的復(fù)制及炎癥反應(yīng)。本論文還在動(dòng)物水平探索PQ對(duì)IAV感染小鼠的免疫損傷的抑制作用。首先利用昆明小鼠建立小鼠肺炎模型,然后檢測(cè)PQ對(duì)小鼠肺指數(shù),肺病毒滴度及炎性因子含量的影響,并觀察小鼠死亡情況。結(jié)果表明,PQ作用后,小鼠肺組織中炎性因子的分泌量顯著降低,肺部病變明顯減輕,肺指數(shù)顯著降低,生存率大大提高。綜上所述,本論文在分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平上利用多種技術(shù)和方法深入地探討了耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ的抗甲型流感病毒作用機(jī)制。研究揭示出PQ是通過抑制與病毒復(fù)制相關(guān)的RTK通路中蛋白的激活,抑制病毒的復(fù)制以及降低機(jī)體炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子的分泌,最終發(fā)揮其抗IAV作用。本文闡釋了新穎小分子PQ是通過靶向RTK通路激活來發(fā)揮抗病毒作用,這與以往研發(fā)抗甲型流感病毒藥物的思路不同,為新型抗流感藥物的研發(fā)提供了篩選靶點(diǎn)和理論參考。
【關(guān)鍵詞】：甲型流感病毒 受體酪氨酸激酶 小分子化合物 免疫損傷 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-13
• 第一章 前言13-27
• 1. 流感病毒的研究概述13-22
• 1.1 流感病毒的結(jié)構(gòu)與形態(tài)13-14
• 1.2 流感病毒的分類和命名14-15
• 1.3 甲型流感病毒的致病機(jī)理15-17
• 1.4 甲型流感的防治方法17-22
• 2 與甲型流感病毒感染相關(guān)的受體酪氨酸激酶(receptortyros ine kinase,RTKs)信號(hào)通路的研究簡(jiǎn)介22-25
• 2.1 Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路23-24
• 2.2 p38 MAPK信號(hào)通路24
• 2.3 NF-kB信號(hào)通路24-25
• 3 微生物藥用開發(fā)25-26
• 4 論文的研究思路與創(chuàng)新點(diǎn)26-27
• 第二章 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ體外抑制IAV感染的研究27-35
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑27-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑27-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材28-29
• 1.3 主要溶液的配制29-30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-32
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存30
• 2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)30
• 2.3 細(xì)胞的傳代30-31
• 2.4 甲型流感病毒的增殖31
• 2.5 甲型流感病毒的毒力測(cè)定31
• 2.6 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ細(xì)胞毒性測(cè)定31-32
• 2.7 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ細(xì)胞水平抗H1N1流感病毒活性測(cè)定32
• 2.8 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ對(duì)細(xì)胞上清中病毒NA含量的影響32
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論32-35
• 第三章 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ對(duì)于IAV復(fù)制相關(guān)的RTK信號(hào)通路的抑制作用研究35-49
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑35-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑35-36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材36-37
• 1.3 主要溶液的配制37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-42
• 2.1 利用western blot研究PQ對(duì)于IAV感染后細(xì)胞中RTK信號(hào)通路蛋白激活的影響37-41
• 2.2 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ的不同作用時(shí)間對(duì)其抗H1N1病毒活性的影響41-42
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論42-49
• 第四章 耐酸真菌次生代謝產(chǎn)物PQ對(duì)于IAV感染小鼠的免疫損傷的抑制作用研究49-56
• 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑49
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑49
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材49
• 2 實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 2.1 小鼠免疫損傷模型的構(gòu)建49-50
• 2.2 給藥和肺指數(shù)計(jì)算50
• 2.3 肺部病毒滴度的測(cè)定50
• 2.4 肺組織病理學(xué)觀察50-51
• 2.5 PQ對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響51-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論52-56
• 第五章 結(jié)語56-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65-66
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文66-67
• 致謝67

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