第一部分:MANF通過促進(jìn)自噬,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對胰島β細(xì)胞的損害目的:探討高糖高脂對人體血清MANF的影響以及在GLU、PA和TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）下,MANF是否能促進(jìn)自噬,減輕ERS,保護(hù)胰島β細(xì)胞。方法:從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌門診及體檢中心收集60例健康對照（NC）、40例單純高脂血癥（HLD）及71例新診2型糖尿�。═2DM）人群的血清標(biāo)本。用人源性MANF ELISA試劑盒檢測血清中MANF水平。利用課題組前期儲備的胰島組織切片,進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證MANF在胰島中的表達(dá)。同時(shí)用小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),利用不同濃度的GLU,PA和TG處理MIN6細(xì)胞24 h后,用Western blotting技術(shù)檢測MANF、ERS、自噬及凋亡蛋白的變化,用CCK8檢測細(xì)胞增殖,以及Hoechst聯(lián)合免疫熒光技術(shù)檢測凋亡現(xiàn)象。用PA處理MIN6細(xì)胞24 h后,用透射電鏡（TEM）檢測細(xì)胞內(nèi)自噬小體和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。PA和TG聯(lián)合自噬抑制劑CQ干預(yù)細(xì)胞后,用Western blotting檢測MANF,ERS和自噬通路蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討MANF與自噬... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

T2DM組、單純高脂血癥組、正常對照組血清MANF水平比較及T2DM亞組分析

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文293.2GLU,PA，TG及GLU+PA刺激對小鼠胰島β細(xì)胞表達(dá)MANF和Insulin蛋白的影響3.2.1MANF在小鼠胰腺組織上有表達(dá)，其中胰島表達(dá)更明顯在小鼠胰腺組織石蠟切片中，免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測到MANF在胰腺組織中的表達(dá)，且在胰島上表達(dá)更明顯，如圖1.2所示。圖1.2免疫組化檢測小鼠胰腺中MANF的表達(dá)400×。Fig1.2MANFproteinexpressioninmousepancreas.3.2.2GLU,PA，TG及GLU+PA刺激下，小鼠胰島β細(xì)胞表達(dá)MANF增加MIN6細(xì)胞在不同濃度的GLU、PA和TG培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。Westernblotting檢測隨著GLU、PA和TG濃度的增加，MANF蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性增加（P﹤0.05）(圖1A、B、C)，且在高濃度的

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文34PA(0.5mM/L)處理MIN6細(xì)胞24h后，透射電鏡檢測觀察發(fā)現(xiàn)，PA處理組線粒體數(shù)量較對照BSA組明顯增多（圖1.7C,D），同時(shí)PA處理組MIN6細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯如圖1.7D綠色的方框所示，以及紅色圓圈所示線粒體受損、膨脹和線粒體嵴明顯減少。而對照BSA處理組未見明顯異常（圖1.7A,B）。損傷的線粒體擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)圖1.7電鏡下PA及BSA處理組的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig1.7SubcellularstructuresofPAandBSAtreatedgroupsunderelectronmicroscopy3.5GLU,PA和TG通過激活mTOR信號通路來抑制自噬之前的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)使用GLU、PA和TG處理MIN6細(xì)胞會增加p62表達(dá)。因此，我們也探討了GLU、PA和TG處理MIN6細(xì)胞后，mTORC1是否會被激活。Westernblotting分析顯示，mTORC1的激活與MIN6細(xì)胞中GLU、PA和TG的濃度有關(guān)，p-mTOR的表達(dá)呈GLU、PA和TG濃度依賴性增加（P﹤0.05）(圖1.8A-C)。


本文編號：3350834