本文關鍵詞：與石房蛤毒素特異結合的適配體的優(yōu)化及其驗證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：石房蛤毒素(STX)是麻痹性貝類毒素家族中的一員,由海洋藻類合成后,通過食物鏈作用富集于甲殼類和軟體動物體內,經(jīng)人類和海洋動物食用后產(chǎn)生麻痹性貝類中毒。該毒素主要通過阻斷可興奮細胞表面的鈉離子通道產(chǎn)生毒性效應。為了保證人類的健康不受威脅,對STX進行檢測尤為重要。然而,STX的檢測,尤其是快速檢測中,最關鍵的部分是STX的分子識別元件。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選出來的能夠與多種靶分子如藥物,蛋白質,其他無機或有機分子高親和力高特異性地結合的一小段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。相對于抗體,它有著多種自身優(yōu)勢,包括其穩(wěn)定性,低免疫原性,易于自動化學合成等,已作為分子識別元件應用于靶分子檢測,疾病診斷,疾病治療等多方面。為了找到候選的STX分子識別元件,先前Handy等人已經(jīng)通過SELEX技術篩選出一條DNA適配體,APTSTX1。然而,它的動力學參數(shù),關于功能的研究以及篩選后的優(yōu)化都沒有得到相關報道,這些對于改善其特性從而更好地應用都是必要的。由于PCR的擴增偏性和實驗操作導致的文庫多樣性降低等原因,一些與靶分子高親和力結合的適配體無法通過SELEX技術篩選出來。多個團隊成功地通過突變的方法對已經(jīng)篩選得到的適配體進行優(yōu)化,并獲得比原始序列親和力更高卻未被篩選出來的序列。本研究中,我們采用類似的方法,在理性分析的基礎上對ApTSTX1進行突變,期望得到潛在的具有更高親和力的適配體。G-四聯(lián)體是一種高度有序高穩(wěn)定性的核酸空間結構,如果經(jīng)過突變適配體能夠形成G-四聯(lián)體結構,則可能會與靶分子結合地更緊密,表現(xiàn)出更高的親和力。因此,我們設計了多條突變序列(包括單點突變及多點突變),將鳥嘌呤核苷酸任一端或兩端的核苷酸也突變?yōu)轼B嘌呤核苷酸,因為鳥嘌呤核苷酸為G-四聯(lián)體結構所必需。借助QGRS Mapper軟件進行結構預測,我們將可能折疊成G-四聯(lián)體結構的序列進行合成并采用生物膜干涉的方法進行親和力測定。其中部分序列與APTSTX1相比親和力得到提高,而親和力最高的是M-30,比APTSTX1提高了30倍。在此基礎上,我們對M-30進一步截短,分別將兩端的游離序列和四個莖-環(huán)結構逐個移除,并進行親和力測定。通過對這些截短序列的結構與親和力之間的關系進行分析,我們發(fā)現(xiàn)其結合STX的核心序列是5’端的兩個莖-環(huán)結構。將其他多余的核苷酸移除后,我們得到M-30f,通過生物膜干涉的方法測得其Kd值為133nM,與M-30相比親和力并未明顯下降。最后,通過多種方法(ELISA,細胞生物學分析和小鼠生物檢測),我們對優(yōu)化前后的兩條適配體(APTSTX1及M-30f)進行了親和力比較,并對它們的STX抑制活性進行了評價。兩條適配體與STX結合的能力在三種方法中都得到驗證。ELISA和細胞生物學測定的結果表明,STX與APTSTX1、M-30f的相互作用間存在顯著的統(tǒng)計學差異,M-30f的結合能力更強,并且兩條適配體均可以拮抗STX的鈉離子通道抑制活性,而M-30f的抑制效果更好�？傊�,優(yōu)化后的序列,M-30f,性能優(yōu)于其母序列。作為STX的分子識別元件,M-30f具有更好的實際應用前景。此外,理性的定點突變和截短是可行的篩選后優(yōu)化策略,這個結論在本研究中也得到證實。
【關鍵詞】：適配體 石房蛤毒素 突變 截短 抑制活性 G-四聯(lián)體
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96;R943
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 實驗材料14-16
• 第一部分、適配體APT~(STX1)的驗證及優(yōu)化16-29
• 一、實驗方法16-19
• (一)、生物膜干涉技術16
• (二)、對APT~(STX1)與STX結合的親和力及特異性進行評價16-18
• (三)、對APT~(STX1)進行優(yōu)化(突變)18-19
• (四)、對突變序列M-30進一步優(yōu)化(截短)19
• (五)、作圖19
• 二、實驗結果19-28
• (一)、適配體APT~(STX1)可以與STX結合,而與STX的類似物不結合19-20
• (二)、對APT~(STX1)進行突變后,親和力提高20-24
• (三)、對突變序列M-30進行截短,找到M-30的最短序列M-30f24-28
• 三、小結28-29
• 第二部分、采用多種方法對優(yōu)化前后的兩條適配體(APT~(STX1)及M-30f)進行比較29-40
• 一、實驗方法29-33
• (一)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)29-31
• (二)、細胞生物學測定31-32
• (三)、MBA32-33
• (四)、統(tǒng)計學分析33
• 二、實驗結果33-39
• (一)、M-30f的STX結合能力優(yōu)于APT~(STX1)(ELISA)33-35
• (二)、M-30f的STX結合能力優(yōu)于APT~(STX1)(細胞水平)35-37
• (三)、M-30f和APT~(STX1)均可以與STX結合(MBA)37-39
• 三、小結39-40
• 討論40-43
• 全文總結43-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-59
• 參考義獻56-59
• 在讀期間發(fā)表論文情況59-60
• 致謝60

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張悅;邢仕歌;王震;康慶賀;凌云;姚美伊;何彥平;金涌;儲曉剛;;核酸適配體在靶向藥物傳遞中的研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2015年03期

2 劉繼紅;胡穎;洪慧杰;張玲;王紅旗;;赭曲霉毒素A核酸適配體篩選[J];食品安全質量檢測學報;2015年09期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳章;新型生物傳感器的構建及其在環(huán)境和生物檢測中的應用研究[D];湖南大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：與石房蛤毒素特異結合的適配體的優(yōu)化及其驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334007