本文關(guān)鍵詞：與石房蛤毒素特異結(jié)合的適配體的優(yōu)化及其驗(yàn)證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：石房蛤毒素(STX)是麻痹性貝類毒素家族中的一員,由海洋藻類合成后,通過食物鏈作用富集于甲殼類和軟體動(dòng)物體內(nèi),經(jīng)人類和海洋動(dòng)物食用后產(chǎn)生麻痹性貝類中毒。該毒素主要通過阻斷可興奮細(xì)胞表面的鈉離子通道產(chǎn)生毒性效應(yīng)。為了保證人類的健康不受威脅,對STX進(jìn)行檢測尤為重要。然而,STX的檢測,尤其是快速檢測中,最關(guān)鍵的部分是STX的分子識別元件。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選出來的能夠與多種靶分子如藥物,蛋白質(zhì),其他無機(jī)或有機(jī)分子高親和力高特異性地結(jié)合的一小段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。相對于抗體,它有著多種自身優(yōu)勢,包括其穩(wěn)定性,低免疫原性,易于自動(dòng)化學(xué)合成等,已作為分子識別元件應(yīng)用于靶分子檢測,疾病診斷,疾病治療等多方面。為了找到候選的STX分子識別元件,先前Handy等人已經(jīng)通過SELEX技術(shù)篩選出一條DNA適配體,APTSTX1。然而,它的動(dòng)力學(xué)參數(shù),關(guān)于功能的研究以及篩選后的優(yōu)化都沒有得到相關(guān)報(bào)道,這些對于改善其特性從而更好地應(yīng)用都是必要的。由于PCR的擴(kuò)增偏性和實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致的文庫多樣性降低等原因,一些與靶分子高親和力結(jié)合的適配體無法通過SELEX技術(shù)篩選出來。多個(gè)團(tuán)隊(duì)成功地通過突變的方法對已經(jīng)篩選得到的適配體進(jìn)行優(yōu)化,并獲得比原始序列親和力更高卻未被篩選出來的序列。本研究中,我們采用類似的方法,在理性分析的基礎(chǔ)上對ApTSTX1進(jìn)行突變,期望得到潛在的具有更高親和力的適配體。G-四聯(lián)體是一種高度有序高穩(wěn)定性的核酸空間結(jié)構(gòu),如果經(jīng)過突變適配體能夠形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu),則可能會(huì)與靶分子結(jié)合地更緊密,表現(xiàn)出更高的親和力。因此,我們設(shè)計(jì)了多條突變序列(包括單點(diǎn)突變及多點(diǎn)突變),將鳥嘌呤核苷酸任一端或兩端的核苷酸也突變?yōu)轼B嘌呤核苷酸,因?yàn)轼B嘌呤核苷酸為G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)所必需。借助QGRS Mapper軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測,我們將可能折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行合成并采用生物膜干涉的方法進(jìn)行親和力測定。其中部分序列與APTSTX1相比親和力得到提高,而親和力最高的是M-30,比APTSTX1提高了30倍。在此基礎(chǔ)上,我們對M-30進(jìn)一步截短,分別將兩端的游離序列和四個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)逐個(gè)移除,并進(jìn)行親和力測定。通過對這些截短序列的結(jié)構(gòu)與親和力之間的關(guān)系進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)其結(jié)合STX的核心序列是5’端的兩個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。將其他多余的核苷酸移除后,我們得到M-30f,通過生物膜干涉的方法測得其Kd值為133nM,與M-30相比親和力并未明顯下降。最后,通過多種方法(ELISA,細(xì)胞生物學(xué)分析和小鼠生物檢測),我們對優(yōu)化前后的兩條適配體(APTSTX1及M-30f)進(jìn)行了親和力比較,并對它們的STX抑制活性進(jìn)行了評價(jià)。兩條適配體與STX結(jié)合的能力在三種方法中都得到驗(yàn)證。ELISA和細(xì)胞生物學(xué)測定的結(jié)果表明,STX與APTSTX1、M-30f的相互作用間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,M-30f的結(jié)合能力更強(qiáng),并且兩條適配體均可以拮抗STX的鈉離子通道抑制活性,而M-30f的抑制效果更好�？傊�,優(yōu)化后的序列,M-30f,性能優(yōu)于其母序列。作為STX的分子識別元件,M-30f具有更好的實(shí)際應(yīng)用前景。此外,理性的定點(diǎn)突變和截短是可行的篩選后優(yōu)化策略,這個(gè)結(jié)論在本研究中也得到證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：適配體 石房蛤毒素 突變 截短 抑制活性 G-四聯(lián)體
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96;R943
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 第一部分、適配體APT~(STX1)的驗(yàn)證及優(yōu)化16-29
• 一、實(shí)驗(yàn)方法16-19
• (一)、生物膜干涉技術(shù)16
• (二)、對APT~(STX1)與STX結(jié)合的親和力及特異性進(jìn)行評價(jià)16-18
• (三)、對APT~(STX1)進(jìn)行優(yōu)化(突變)18-19
• (四)、對突變序列M-30進(jìn)一步優(yōu)化(截短)19
• (五)、作圖19
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-28
• (一)、適配體APT~(STX1)可以與STX結(jié)合,而與STX的類似物不結(jié)合19-20
• (二)、對APT~(STX1)進(jìn)行突變后,親和力提高20-24
• (三)、對突變序列M-30進(jìn)行截短,找到M-30的最短序列M-30f24-28
• 三、小結(jié)28-29
• 第二部分、采用多種方法對優(yōu)化前后的兩條適配體(APT~(STX1)及M-30f)進(jìn)行比較29-40
• 一、實(shí)驗(yàn)方法29-33
• (一)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)29-31
• (二)、細(xì)胞生物學(xué)測定31-32
• (三)、MBA32-33
• (四)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-39
• (一)、M-30f的STX結(jié)合能力優(yōu)于APT~(STX1)(ELISA)33-35
• (二)、M-30f的STX結(jié)合能力優(yōu)于APT~(STX1)(細(xì)胞水平)35-37
• (三)、M-30f和APT~(STX1)均可以與STX結(jié)合(MBA)37-39
• 三、小結(jié)39-40
• 討論40-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-59
• 參考義獻(xiàn)56-59
• 在讀期間發(fā)表論文情況59-60
• 致謝60

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張悅;邢仕歌;王震;康慶賀;凌云;姚美伊;何彥平;金涌;儲曉剛;;核酸適配體在靶向藥物傳遞中的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2015年03期

2 劉繼紅;胡穎;洪慧杰;張玲;王紅旗;;赭曲霉毒素A核酸適配體篩選[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào);2015年09期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳章;新型生物傳感器的構(gòu)建及其在環(huán)境和生物檢測中的應(yīng)用研究[D];湖南大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 朱瑩;多西紫杉醇核酸適配體的高效篩選及其特性的初步考察[D];湖南大學(xué);2013年

2 MICHAEL JOHN DONOVAN;[D];湖南大學(xué);2013年

3 何詠;功能化熒光核酸探針用于腺苷和pH的檢測[D];湖南大學(xué);2014年

4 郭曉東;黃曲霉毒素適配體傳感器檢測方法建立及其穩(wěn)定性研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 梁少君;硫酸軟骨素共價(jià)修飾PAMAM傳遞miR-34a治療CD44陽性腫瘤的研究[D];吉林大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：與石房蛤毒素特異結(jié)合的適配體的優(yōu)化及其驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334007