本文關(guān)鍵詞：Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模型的構(gòu)建及胰島素敏感性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人們很早就知道脂肪組織是人體最大的儲能器官,隨著上個世紀(jì)九十年代Leptin(瘦素)的發(fā)現(xiàn),人們逐漸意識到脂肪組織也是一個高度活躍的內(nèi)分泌器官,它能分泌各種生物活性肽或蛋白質(zhì),統(tǒng)稱為脂肪因子,參與調(diào)節(jié)機體許多重要的病理生理過程。由于肥胖已成為全球性健康問題,是許多重要疾病的主要危險因子,而體內(nèi)脂肪組織過多又是肥胖患者的重要特點之一,因此,了解脂肪因子與肥胖的關(guān)系,探索脂肪因子的具體生理功能,對治療肥胖產(chǎn)生的病理學(xué)后果是非常有價值的。目前,人們對于脂肪因子的研究已取得許多重要進展,比如有學(xué)者提出用Leptin或Leptin聯(lián)合低劑量胰島素治療糖尿病,有助于維持血糖穩(wěn)態(tài)；我們前期大量研究證明Visfatin可以作為治療腦卒中的新靶點,等等。在過去二十年間,不斷有新的脂肪因子被發(fā)現(xiàn),目前科學(xué)界大概報道了超過100種脂肪因子。本室于2008年首次利用限食模型找到了一個新的脂肪因子,取名為Subfatin。本室前期的初步試驗結(jié)果表明：Subfatin在白色脂肪組織表達較高,其在限食大鼠的白色脂肪組織中表達下調(diào),而在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠白色脂肪組織中表達上調(diào),在脂肪細胞分化過程中表達逐漸升高。據(jù)此我們認為,Subfatin可能參與脂肪功能的調(diào)節(jié),并影響肥胖及機體代謝。制備脂肪細胞特異性過表達的轉(zhuǎn)基因動物模型,是研究脂肪因子整體功能的可靠手段之一。為了研究脂肪細胞來源的Subfatin對脂肪組織生物學(xué)及代謝功能的影響,本課題構(gòu)建了Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模型,并對該小鼠模型的胰島素敏感性進行了探索。實驗方法1.pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒的構(gòu)建(1)利用pIRES-EGFP-Subfatin質(zhì)粒PCR擴增獲得Subfatin cDNA -his6,并將其插入pBS aP2 promoter (5.4 kb) poly A質(zhì)粒,構(gòu)建了 pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒,即Subfatin脂肪組織特異性過表達載體。(2)對pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒進行基因測序。2.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備(1)將線性化的載體片段(含aP2 promoter、Subfatin cDNA-his6、Poly A)顯微注射進C57BL/6小鼠的受精卵中。(2)將受精卵移植入C57BL/6假孕母鼠的輸卵管壺腹部,監(jiān)護假孕母鼠生產(chǎn),鑒定F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型。(3)選出陽性首建鼠,與C57BL/6小鼠回交,獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠,鑒定基因型。3.轉(zhuǎn)基因小鼠的表達驗證(1)應(yīng)用半定量RT-PCR, Real-time PCR的方法檢測Subfatin基因的轉(zhuǎn)錄情況。(2)應(yīng)用免疫組化的方法檢測脂肪組織Subfatin蛋白的表達情況。(3)用ELISA測定血清中Subfatin蛋白的濃度。4.轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性研究(1)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠的體重、食量進行稱重。(2)在正常飲食和高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進行葡萄糖耐量實驗(GTT)。(3)在高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進行胰島素耐量實驗(ITT)。(4)在高脂飲食條件下對轉(zhuǎn)基因小鼠進行高胰島素性正糖(HIEG)鉗夾實驗。結(jié)果1.基因測序結(jié)果表明,pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin質(zhì)粒上aP2 Promoter-Subfatin區(qū)域的核苷酸序列分別與小鼠aP2 Promoter基因核苷酸序列及Subfatin mRNA編碼序列一致。說明Subfatin脂肪組織特異性過表達載體構(gòu)建成功。2.對假孕母鼠產(chǎn)下的F0代轉(zhuǎn)基因小鼠進行基因型鑒定,得到四只陽性首建鼠。3.半定量RT-PCR結(jié)果表明,在所取的腦組織、腎組織、心臟組織、肌肉組織、棕色脂肪組織和白色脂肪組織中,外源性Subfatin (Subfatin-his6)只有在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中是過表達的。4. Real-time PCR結(jié)果表明,Subfatin在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中的轉(zhuǎn)錄水平大大高于野生型小鼠,說明轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達的。5.免疫組化的結(jié)果表明,Subfatin蛋白在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠白色脂肪組織中的表達明顯高于野生型小鼠,同樣說明轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中Subfatin是過表達的。6. ELISA的結(jié)果表明,Subfatin蛋白在陽性轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的濃度的確高于野生型小鼠,該結(jié)果與Subfatin蛋白的分泌性質(zhì)相符合,同時也驗證了其在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)是過表達的。7.在正常飲食或高脂飲食飼養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的體重、食量均無顯著性差異。8.GTT實驗結(jié)果表明,在正常飲食飼養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的胰島素敏感性無顯著差異；而在高脂飲食飼養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性明顯高于野生型小鼠。9.ITT實驗、HIEG鉗夾實驗結(jié)果均表明,在高脂飲食飼養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性明顯高于野生型小鼠。綜上所述,本課題成功構(gòu)建了Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)高脂飲食飼養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性明顯高于野生型小鼠,說明脂肪組織Subfatin能對抗高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。
【關(guān)鍵詞】：Subfatin 脂肪因子 脂肪特異性過表達 轉(zhuǎn)基因小鼠 胰島素敏感性
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-17
• 第一部分 構(gòu)建表達載體pBluescriptⅡSK(+)-aP2-Subfatin17-37
• 一、引言17-19
• 二、實驗材料與方法19-30
• (一) 目的基因片段的擴增與回收19-22
• (二) 目的基因插入表達載體22-25
• (三) 轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒抽提25-27
• (四) 鑒定陽性菌落27-30
• 三、結(jié)果與討論30-37
• (一) 目的基因的擴增與回收30-31
• (二) 陽性菌落鑒定結(jié)果31-32
• (三) 陽性克隆測序32-37
• 第二部分 Subfatin脂肪特異性過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定及培育37-60
• 一、引言37-39
• 二、實驗材料與方法39-55
• (一) 陽性首建鼠的基因鑒定39-41
• (二) 轉(zhuǎn)基因小鼠的mRNA表達檢測41-46
• (三) 轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織表達Subfatin蛋白的檢測46-50
• (四) 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中Subfatin蛋白的濃度測定50-53
• (五) 轉(zhuǎn)基因小鼠擴大繁殖53-55
• 三、結(jié)果與討論55-60
• (一) 陽性首建鼠的確立55-56
• (二) 各組織的RT-PCR結(jié)果56
• (三) Real-time PCR結(jié)果56-57
• (四) 轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織Subfatin蛋白的檢測57-58
• (五) 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中Subfatin蛋白濃度的測定58
• (六) 轉(zhuǎn)基因小鼠的擴大繁殖58-60
• 第三部分 轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素敏感性研究60-76
• 一、引言60
• 二、實驗材料與方法60-70
• (一) 體重、食量測定60-61
• (二) 葡萄糖耐量實驗61-63
• (三) 血清中胰島素濃度測定63-64
• (四) 胰島素耐量實驗64-66
• (五) 高胰島素性正糖鉗夾實驗66-70
• 三、結(jié)果與討論70-76
• (一) 體重、食量70-72
• (二) 葡萄糖耐量實驗72-74
• (三) 胰島素耐量實驗74-75
• (四) 高胰島素性正糖鉗夾實驗75-76
• 全文總結(jié)76-77
• 參考文獻77-82
• 綜述82-92
• 參考文獻89-92
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明92-93
• 附錄93-104
• 致謝104

【共引文獻】

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5 楊芳;;2-氨基嘌呤對小鼠的毒理學(xué)研究[J];數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志;2014年04期

6 楊德智;楊芳;;2-氨基嘌呤對小鼠的毒理學(xué)研究[J];數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志;2014年06期

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5 霍寧;T2DM患者胃轉(zhuǎn)流術(shù)后人體測量學(xué)指標(biāo)的變化及與胰島素抵抗的相關(guān)性[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2014年

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  本文關(guān)鍵詞：Subfatin脂肪特異性過表達小鼠模型的構(gòu)建及胰島素敏感性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：329670