發(fā)布時間：2021-07-21 20:34

　　細菌耐藥性是困擾感染性疾病臨床治療的難題之一;通過新策略降低細菌的藥物耐受力、大幅提高藥物殺菌活性,能有效遏制耐藥性產(chǎn)生。喹諾酮是臨床廣泛使用的廣譜抗菌藥[1],自1962年第一代喹諾酮類藥物萘啶酮酸發(fā)明以來,四代、成百上千種喹諾酮衍生物已經(jīng)被成功合成,并且細菌ⅡA型拓撲異構(gòu)酶（DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ）已經(jīng)被確認為該類抗菌藥物的作用靶點[2-4]。先前的研究表明:細菌DNA復(fù)制過程對菌體生長與存活至關(guān)重要,而這一過程需要DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的共同作用。在過去50多年中,喹諾酮類藥物的廣泛使用也說明這一藥物作用靶點在臨床治療上的重要性;但是由于對喹諾酮類藥物不恰當(dāng)?shù)氖褂媚酥翞E用,導(dǎo)致細菌耐藥性的逐步上升,為確保這一行之有效的抗菌藥物繼續(xù)發(fā)揮其良好的治療效果,確定其殺菌途徑及作用機理迫在眉睫。我們新近證明喹諾酮可通過2條不同途徑進行殺菌,各途徑分別由不同的未知關(guān)鍵蛋白控制;并已篩選獲得喹諾酮壓力下既不生長也不死亡的藥物耐受突變體。本課題以喹諾酮殺菌的2條途徑為研究對象,利用已建立的藥物耐受突變體富集/篩選技術(shù)、結(jié)合基因組測序,破譯“蛋白從頭合成依賴型”殺菌途徑的關(guān)鍵效應(yīng)調(diào)節(jié)“致死... 

【文章來源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２基因自發(fā)回復(fù)突變分析??

中進行誘導(dǎo)表達，通過調(diào)整誘導(dǎo)劑ＩＰＴＧ濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間三個參數(shù)，分??別摸索兩種蛋白最適宜的表達條件。在誘導(dǎo)表達完成后進行超聲破碎，離心后上清??使用變性劑變性，之后進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，實驗結(jié)果如圖４：??／／７／０＇?／／／?Ｚ？／＾／／／／??ＪＩＨｌｉｌ?ＷＨＩＰ??Ｓｉｌｎ！?Ｉ！?＝?ＩＳＳｆｔ??圖４野生型及突變型ＰｕｒＢ蛋白表達條件摸索??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?ａｎｄ?ｍｕｔａｎｔ?ＰｕｒＢ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??由上述結(jié)果圖可以發(fā)現(xiàn)，野生型ＰｕｒＢ蛋白最適宜的誘導(dǎo)條件是０．５ｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下誘導(dǎo)８ｈ；而突變型ＰｕｒＢ蛋白最適宜的誘導(dǎo)表達條件是Ｏ．ｌｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下誘導(dǎo)８ｈ。在確定該條件后進行大量誘導(dǎo)表達，得到未純化的兩種??蛋白樣品，之后使用Ｎｉ－ＮＴＡ瓊脂糖凝膠（Ｈｉｓ標(biāo)簽純化樹脂）進行純化，得到大量純??化后的野生型和突變型ＰｕｒＢ蛋白樣品，再對這兩種蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，使用Ｐｙｍｏｌ??對三維結(jié)構(gòu)進行模擬

圖７ｐｗｒｖ４基因缺失表現(xiàn)出喹諾酮耐受表型??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｍｕｔａｎｔ?ｏｆｐｕｒＡ?ｓｈｏｗｓ?ａ?ｔｏｌｅｒａｎｔ?ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ?ｔｏ?ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ??從圖中可以發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，／ｗｄ基因缺失菌株表現(xiàn)出很強的耐受作??用，其耐受水平與基因缺失菌株基本一致，這一結(jié)果說明喹諾酮“蛋白從頭合??成依賴型”殺菌途徑與第一種假設(shè)－嘌呤生物合成代謝通路相關(guān)，而基因在該??通路中會起到兩次作用，分別催化合成了?ＩＭＰ（次黃嗓呤）和ＡＭＰ?（腺嘌呤），所以??接下來實驗?zāi)康氖沁M一步確定其在嘌呤生物合成代謝通路中的哪…個環(huán)節(jié)起到關(guān)鍵??作用，通過代謝通路中的各關(guān)鍵中間產(chǎn)物回補ｐｗＭ基因缺失菌株，驗證其殺菌表型??變化，起關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物在回補基因缺失菌株后，應(yīng)該可使其耐受表型消??失，各關(guān)鍵中間產(chǎn)物回補；基因缺失菌株殺菌表型如圖８、圖９：??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]喹諾酮類藥物及細菌對其耐藥性機制研究進展[J]. 夏蕊蕊,國憲虎,張玉臻,徐海.  中國抗生素雜志. 2010(04)
[2]喹諾酮類抗菌藥研究的新進展[J]. 張致平.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊). 2001(06)



本文編號：3295729