細(xì)菌耐藥性是困擾感染性疾病臨床治療的難題之一;通過新策略降低細(xì)菌的藥物耐受力、大幅提高藥物殺菌活性,能有效遏制耐藥性產(chǎn)生。喹諾酮是臨床廣泛使用的廣譜抗菌藥[1],自1962年第一代喹諾酮類藥物萘啶酮酸發(fā)明以來,四代、成百上千種喹諾酮衍生物已經(jīng)被成功合成,并且細(xì)菌ⅡA型拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ）已經(jīng)被確認(rèn)為該類抗菌藥物的作用靶點(diǎn)[2-4]。先前的研究表明:細(xì)菌DNA復(fù)制過程對(duì)菌體生長與存活至關(guān)重要,而這一過程需要DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的共同作用。在過去50多年中,喹諾酮類藥物的廣泛使用也說明這一藥物作用靶點(diǎn)在臨床治療上的重要性;但是由于對(duì)喹諾酮類藥物不恰當(dāng)?shù)氖褂媚酥翞E用,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的逐步上升,為確保這一行之有效的抗菌藥物繼續(xù)發(fā)揮其良好的治療效果,確定其殺菌途徑及作用機(jī)理迫在眉睫。我們新近證明喹諾酮可通過2條不同途徑進(jìn)行殺菌,各途徑分別由不同的未知關(guān)鍵蛋白控制;并已篩選獲得喹諾酮壓力下既不生長也不死亡的藥物耐受突變體。本課題以喹諾酮?dú)⒕?條途徑為研究對(duì)象,利用已建立的藥物耐受突變體富集/篩選技術(shù)、結(jié)合基因組測(cè)序,破譯“蛋白從頭合成依賴型”殺菌途徑的關(guān)鍵效應(yīng)調(diào)節(jié)“致死... 

【文章來源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２基因自發(fā)回復(fù)突變分析??

中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過調(diào)整誘導(dǎo)劑ＩＰＴＧ濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)參數(shù)，分??別摸索兩種蛋白最適宜的表達(dá)條件。在誘導(dǎo)表達(dá)完成后進(jìn)行超聲破碎，離心后上清??使用變性劑變性，之后進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖４：??／／７／０＇?／／／?Ｚ？／＾／／／／??ＪＩＨｌｉｌ?ＷＨＩＰ??Ｓｉｌｎ！?Ｉ！?＝?ＩＳＳｆｔ??圖４野生型及突變型ＰｕｒＢ蛋白表達(dá)條件摸索??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ?ａｎｄ?ｍｕｔａｎｔ?ＰｕｒＢ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??由上述結(jié)果圖可以發(fā)現(xiàn)，野生型ＰｕｒＢ蛋白最適宜的誘導(dǎo)條件是０．５ｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下誘導(dǎo)８ｈ；而突變型ＰｕｒＢ蛋白最適宜的誘導(dǎo)表達(dá)條件是Ｏ．ｌｍＭ??ＩＰＴＧ，在２８°Ｃ下誘導(dǎo)８ｈ。在確定該條件后進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，得到未純化的兩種??蛋白樣品，之后使用Ｎｉ－ＮＴＡ瓊脂糖凝膠（Ｈｉｓ標(biāo)簽純化樹脂）進(jìn)行純化，得到大量純??化后的野生型和突變型ＰｕｒＢ蛋白樣品，再對(duì)這兩種蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，使用Ｐｙｍｏｌ??對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬

圖７ｐｗｒｖ４基因缺失表現(xiàn)出喹諾酮耐受表型??Ｆｉｇｕｒｅ?７．?Ｍｕｔａｎｔ?ｏｆｐｕｒＡ?ｓｈｏｗｓ?ａ?ｔｏｌｅｒａｎｔ?ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ?ｔｏ?ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ??從圖中可以發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，／ｗｄ基因缺失菌株表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受作??用，其耐受水平與基因缺失菌株基本一致，這一結(jié)果說明喹諾酮“蛋白從頭合??成依賴型”殺菌途徑與第一種假設(shè)－嘌呤生物合成代謝通路相關(guān)，而基因在該??通路中會(huì)起到兩次作用，分別催化合成了?ＩＭＰ（次黃嗓呤）和ＡＭＰ?（腺嘌呤），所以??接下來實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)一步確定其在嘌呤生物合成代謝通路中的哪…個(gè)環(huán)節(jié)起到關(guān)鍵??作用，通過代謝通路中的各關(guān)鍵中間產(chǎn)物回補(bǔ)ｐｗＭ基因缺失菌株，驗(yàn)證其殺菌表型??變化，起關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物在回補(bǔ)基因缺失菌株后，應(yīng)該可使其耐受表型消??失，各關(guān)鍵中間產(chǎn)物回補(bǔ)；基因缺失菌株殺菌表型如圖８、圖９：??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]喹諾酮類藥物及細(xì)菌對(duì)其耐藥性機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 夏蕊蕊,國憲虎,張玉臻,徐海.  中國抗生素雜志. 2010(04)
[2]喹諾酮類抗菌藥研究的新進(jìn)展[J]. 張致平.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè)). 2001(06)



本文編號(hào)：3295729