發(fā)布時(shí)間：2021-07-02 20:48

　　甲硝唑是一種硝基咪唑衍生物藥物,憑借其出色的抗菌性能而聞名,對(duì)滴蟲(chóng)、阿米巴原蟲(chóng)和厭氧菌有效,然而過(guò)度使用甲硝唑會(huì)有致畸、致癌和引發(fā)神經(jīng)中毒的風(fēng)險(xiǎn)。因此,有必要開(kāi)發(fā)一種具有高靈敏度和高選擇性的甲硝唑測(cè)定方法。適配體是具有獨(dú)特性質(zhì)的單鏈寡核苷酸序列,可以折疊成特定的3D結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合各種靶標(biāo)。適配體是通過(guò)化學(xué)合成方法制造的,因此不會(huì)誘導(dǎo)免疫原性,并且可以進(jìn)行化學(xué)修飾以提高穩(wěn)定性或?qū)崿F(xiàn)標(biāo)記,這樣可以實(shí)現(xiàn)可重復(fù)、廉價(jià)和快速的生產(chǎn)。適配體選自含有約10¹⁵個(gè)不同序列的寡核苷酸文庫(kù),通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選適配體。SELEX由重復(fù)的篩選和擴(kuò)增組成,在每個(gè)循環(huán)中,保留、回收和擴(kuò)增對(duì)靶標(biāo)具有特定親和力的寡核苷酸。在10-15個(gè)循環(huán)后,SELEX就可以得到一個(gè)由與既定的靶標(biāo)結(jié)的寡核酸序列組成的富集文庫(kù),其中結(jié)合親和力強(qiáng)并且特異性良好的最優(yōu)序列最終可以稱(chēng)為適配體。適配體的截短是提高親和力并降低檢測(cè)成本的有效策略,原始適配體在應(yīng)用時(shí)序列太長(zhǎng),因此需要進(jìn)一步優(yōu)化獲得更高效的適配體�；诠潭―NA文庫(kù)的磁珠-SELEX技術(shù),從全長(zhǎng)為79nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)中篩選... 

【文章來(lái)源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

適配體通過(guò)構(gòu)象互補(bǔ)識(shí)別并結(jié)合其靶標(biāo)Fig.1-1Aptamersrecognizeandbindtheirtargetviaconformationalcomplementary

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1-2SELEX技術(shù)篩選示意圖Fig.1-2SELEXtechnologyscreeningdiagram1.2.2SELEX技術(shù)的發(fā)展傳統(tǒng)的SELEX幾經(jīng)進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用，篩選得到很多高效的“明星”適配體。近年來(lái)，開(kāi)發(fā)了許多方法來(lái)更可靠和有效地產(chǎn)生適配體。本文主要分析一些適配體領(lǐng)域最新篩選方法和新興SELEX技術(shù)。這些方法和技術(shù)主要通過(guò)指數(shù)富集方法SELEX進(jìn)行的配體系統(tǒng)進(jìn)化及其變化，例如免疫沉淀偶聯(lián)SELEX（IP-SELEX），捕獲SELEX（Capture-SELEX），細(xì)胞SELEX（Cell-SELEX），毛細(xì)管電泳SELEX（CE-SELEX），原子力顯微鏡SELEX（AFM-SELEX）和人工擴(kuò)展的遺傳信息系統(tǒng)SELEX（AEGIS-SELEX）。（1）免疫沉淀偶聯(lián)SELEX（IP-SELEX）適配體的親和力和特異性在很大程度上取決于其靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)。由于人工重組蛋白的三維目標(biāo)可能與其天然構(gòu)象不同，因此在標(biāo)準(zhǔn)生理?xiàng)l件下體外篩選適配體往往可能并不是篩選到具有最高親和力和特異性的適配體的最佳方法[27]。開(kāi)發(fā)IP-SELEX就是為了解決這個(gè)問(wèn)題。盡管IP-SELEX可與傳統(tǒng)SELEX方法相提并論，但它包括免疫沉淀步驟，可將天然形式的所需靶標(biāo)“拉扯”下來(lái)。這導(dǎo)致適配體的富集在正常生理?xiàng)l件下仍具有識(shí)別蛋白質(zhì)的能力。在IP-SELEX的第一輪篩選中，將帶有目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞與ssDNA文庫(kù)在緩沖液和適合的條件下孵育。隨后，裂解細(xì)胞，并使用抗體包被的磁珠免疫沉淀目標(biāo)蛋白。幾輪洗滌后，從珠上洗脫蛋白-適配體復(fù)合物，并PCR擴(kuò)增DNA序列以進(jìn)行下一輪篩眩重復(fù)篩選對(duì)靶標(biāo)具有高特異性和親和力的寡核苷酸的過(guò)程，從而使它們最終富集，最后通過(guò)測(cè)序確定篩選的適配體[28]。（2）捕獲SELEX（Capture-SELEX）與大多數(shù)SELEX方法需要將靶標(biāo)固定在固體表面上相比，Capture-SELEX用于可溶性小分子靶標(biāo)。Capture-SELEX利用一個(gè)特殊的

80%，據(jù)報(bào)道，食用動(dòng)物中使用的抗生素達(dá)到1.46萬(wàn)噸[69,70]。根據(jù)貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型，流行病學(xué)家VanBoeckel小組[71]進(jìn)行了保守的估計(jì)，全球食用動(dòng)物中的抗生素消費(fèi)量到2030年將達(dá)到驚人的20萬(wàn)噸。人類(lèi)和獸用抗生素的廣泛使用導(dǎo)致抗生素不斷釋放到環(huán)境中，目前在地表水和廢水中檢測(cè)到多種抗生素殘留物。由于當(dāng)前市政飲用水和廢水處理基礎(chǔ)設(shè)施缺乏抗生素去除功能，因此飲用水源中很有可能已經(jīng)污染并殘留抗生素。鑒于此，我們需要確定食用動(dòng)物和飲用水源中過(guò)度使用抗生素造成的威害，并且實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)抗生素。圖1-3甲硝唑分子的分子結(jié)構(gòu)與3D結(jié)構(gòu)圖Fig.1-3Molecularstructureand3Dstructureofmetronidazolemolecule甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾?lèi)抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的抗菌抗原蟲(chóng)藥物。甲硝唑?yàn)榘咨翜\黃色結(jié)晶性粉末，有輕微氣味苦咸味，pH（飽和水溶液）約為6.5，熔點(diǎn)為158-160℃，結(jié)構(gòu)如圖1-3所示。甲硝唑用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆腔感染，皮膚軟組織、骨和骨關(guān)節(jié)等部位的感染等，此外還廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療口腔厭氧菌。甲硝唑作為禽類(lèi)、畜類(lèi)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]硝基咪唑類(lèi)藥物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 尚彬如,張麗英.  中國(guó)畜牧雜志. 2010(01)



本文編號(hào)：3261201