目的:尋找MDM2的多肽抑制劑,從多角度探討多肽藥物在靶向腫瘤治療中的潛在價(jià)值。方法:通過分子模擬對(duì)接技術(shù)對(duì)已有多肽庫中的102條多肽進(jìn)行結(jié)合測(cè)試;使用Alpha-lisa技術(shù),分析多肽對(duì)MDM2與p53相互作用的影響;BIAcore技術(shù)研究多肽與MDM2的相互作用,及對(duì)MDM2和p53之間結(jié)合的影響;Western Blotting法檢測(cè)多肽對(duì)MCF-7細(xì)胞中MDM2、p53及p21表達(dá)的影響。結(jié)果:Alpha-lisa對(duì)分子對(duì)接中得分較高的多肽進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的Peptide 58:Ser-Tyr-Val-Trp及Peptide 95:Ala-Ser-Asp-Phe兩條多肽對(duì)MDM2與p53結(jié)合破壞較大,分別在50.0和80.0 nmol/L即可產(chǎn)生抑制（Peptide 58:t=5.36,P<0.05,Peptide 95:t=31.26,P<0.05）;BIAcore實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Peptide 58與Peptide 95可特異性的與MDM2結(jié)合,較p53相比。它們與MDM2的結(jié)合常數(shù)分別為（389.6±13.4）nmol/L和（1.6±0.2）μmol/L,而... 

【文章來源】：現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué). 2020,28(17)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

MDM2與102條多肽分子對(duì)接篩選結(jié)果

結(jié)果顯示,MDM2與p53蛋白有較強(qiáng)的相互作用,在682 nm激發(fā)下,615 nm處發(fā)出強(qiáng)烈熒光信號(hào)。多肽處理組中,Peptide 58與Peptide 95在實(shí)驗(yàn)中對(duì)MDM2與p53間的相互作用表現(xiàn)出了明顯的抑制性,分別在50和80 nmol/L的濃度以 后,與陰性對(duì)照組比較差異顯著 (Peptide 58:t=5.36,P<0.05,Peptide 95:t=31.26,P<0.05),IC50分別為(603.2±5.6)nmol/L和(2.5±0.2)μmol/L 。而相同條件下其他多肽均要超過800 nmol/L才能產(chǎn)生顯著抑制(P<0.05),IC50值預(yù)計(jì)均超過4.0 μmol/L,結(jié)果如圖2所示。另外,作為MDM2的陽性抑制劑Nutlin 3則在20 nmol/L即產(chǎn)生了顯著抑制(t=19.36,P<0.05),其IC50值為(92.3±6.3)nmol/L。上圖 結(jié)果顯示除Peptide 58:Ser-Tyr-Val-Trp與 Peptide 95:Ala-Ser-Asp-Phe抑制效果表現(xiàn)良好外,其他多肽在規(guī)定濃度內(nèi)并未表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。為進(jìn)一步探究這兩條多肽對(duì)MDM2與p53相互作用的抑制機(jī)制,我們對(duì)比了這些多肽與MDM2的分子對(duì)接方式。對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn),如圖3所示,除Peptide 58與Peptide 95與MDM2能形成氫鍵外,其他8條多肽均未發(fā)現(xiàn)有氫鍵形成(未在文中顯示)。一般情況,氫鍵是相互作用中較為重要的一種作用力,其能量較高,結(jié)合力較強(qiáng),能讓配體與供體結(jié)合成為穩(wěn)定的復(fù)合體。對(duì)比二者結(jié)合的位置可見,兩條肽與MDM2均結(jié)合在同一個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi),因此推斷二者阻斷MDM2與p53結(jié)合的機(jī)制是一致的。除此之外,還有更重要的現(xiàn)象,即這兩條肽中,都至少含有一個(gè)苯環(huán)的氨基酸,這兩個(gè)多肽上的苯環(huán)與MDM2中的第96位組氨酸上的咪唑基團(tuán)形成了π-π堆積,這種堆積效應(yīng)與氫鍵相似,進(jìn)一步加強(qiáng)了二者間的相互作用[11,12]。這種相似的情況,在Nutlin 3與MDM2的對(duì)接結(jié)果中也被發(fā)現(xiàn),如圖3C所示,Nutlin 3與MDM2的預(yù)測(cè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與兩條多肽一致,其化合物結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)也與MDM2中的第96位組氨酸上的咪唑基團(tuán)形成了π-π堆積,因此可以推測(cè)這種π-π堆積對(duì)配體與MDM2的結(jié)合具有較為重要的意義。

上節(jié)實(shí)驗(yàn)證明了Peptide 58與Peptide 95能抑制MDM2與p53間的相互作用,但無法證明這種抑制是通過直接作用MDM2實(shí)現(xiàn)的,本節(jié)實(shí)驗(yàn),我們使用BIAcore實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步揭示多肽的作用機(jī)制。如圖4,結(jié)果與預(yù)期一致,Peptide 58與Peptide 95對(duì)MDM2表現(xiàn)出了較強(qiáng)的結(jié)合,結(jié)合常數(shù)分別為(389.6±13.4)nmol/L和(1.6±0.2)μmol/L。平行實(shí)驗(yàn)中,這兩臺(tái)多肽與p53也呈現(xiàn)了一定的結(jié)合,結(jié)合常數(shù)分別為(19.5±2.4)μmol/L和(12.8±1.4)μmol/L, 與MDM2結(jié)合組差異顯著(Peptide 58:t= 6.85,P<0.01,Peptide 95:t=8.32,P<0.01)表明這兩條多肽相對(duì)于p53而言,對(duì)MDM2具有較高的選擇性。圖4 BIAcore實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩條多肽與MDM2和p53的結(jié)合情況


本文編號(hào)：3225953